高效液相法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量研究①

劉慧東，李錦蓮，武冬梅

(1.黑龍江省開(kāi)拓輻射技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

高效液相法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量研究①

劉慧東1，李錦蓮2，武冬梅2

(1.黑龍江省開(kāi)拓輻射技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：改進(jìn)細(xì)胞收集方法以提高高效液相法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤的效率。方法：采用高效液相法檢測(cè)原位和傳統(tǒng)兩種收集方法獲得的細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果：原位收集獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中黃嘌呤，次黃嘌呤，腺嘌呤濃度均高于傳統(tǒng)收集細(xì)胞法獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)相應(yīng)的嘌呤濃度。結(jié)論：與傳統(tǒng)的細(xì)胞收集法相比，原位細(xì)胞收集法更能得到含量較高的嘌呤。

高效液相法；嘌呤；MCF-7細(xì)胞

嘌呤是核苷酸代謝中間產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量的檢測(cè)對(duì)核苷酸代謝相關(guān)生理、病理過(guò)程的研究有重要意義[1～3]。高效液相(HPLC)法是經(jīng)典的定量檢測(cè)方法[4～6]，然而此法目前采用的細(xì)胞收集和前處理方式復(fù)雜，所需細(xì)胞大，不僅造成檢測(cè)價(jià)格昂貴，而且所需時(shí)間較長(zhǎng)，易造成檢測(cè)信號(hào)的丟失，因此改進(jìn)細(xì)胞前處理方式，提高信號(hào)強(qiáng)度，縮短前處理時(shí)間，以便節(jié)省細(xì)胞培養(yǎng)，保證檢測(cè)的精確度，具有重要意義。本文改進(jìn)了原始的細(xì)胞需要消化、離心、重懸、裂解的收集過(guò)程，直接在培養(yǎng)皿中原位裂解收集，大大縮短了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，降低了細(xì)胞收集所需費(fèi)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀，美國(guó)；HH.CP-T型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；人乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7，東北林業(yè)大學(xué)贈(zèng)送；優(yōu)級(jí)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素和青霉素，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2 MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

MCF-7細(xì)胞加適量DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底的MCF-7細(xì)胞按下述兩種方法收集。

傳統(tǒng)細(xì)胞收集法：將細(xì)胞依次進(jìn)行消化、吹打懸浮、離心(1000 r·min-1，10 min)后得細(xì)胞沉淀，所得細(xì)胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液沖洗3次，然后用適量的pH 7.4 PBS溶液配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。所得細(xì)胞懸液在水浴50℃作用30 min后獲得待測(cè)細(xì)胞質(zhì)。

原位細(xì)胞收集法：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底的細(xì)胞用PBS清洗3次，加入適量的pH 7.4 PBS在水浴50℃作用30min后獲得待測(cè)細(xì)胞質(zhì)。

1.3 HPLC測(cè)試條件

Ascenis RP-Amide 柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)；DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流動(dòng)相為的磷酸二氫鉀溶液，pH=4.0；流速為1.0mL·min-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 原位法與傳統(tǒng)法收集MCF-7細(xì)胞質(zhì)內(nèi)嘌呤HPLC法檢測(cè)

圖1為HPLC法檢測(cè)原位收集的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中嘌呤堿基信號(hào)峰。并與傳統(tǒng)收集過(guò)程做了比較。原位收集的MCF-7細(xì)胞質(zhì)(圖1-a)高效液相色譜信號(hào)峰明顯大于傳統(tǒng)收集的MCF-7細(xì)胞質(zhì)信號(hào)峰(圖1-b)。

圖1 HPLC檢測(cè)原位收集獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中電活性物質(zhì)的含量 (a)原位收集MCF-7細(xì)胞，(b)傳統(tǒng)收集法MCF-7細(xì)胞 細(xì)胞濃度：2.0×106 cells·mL-1

2.2 HPLC法測(cè)定嘌呤堿基標(biāo)準(zhǔn)曲線

見(jiàn)圖2。如圖2所示，隨著嘌呤濃度的增加，高效液相色譜法檢測(cè)的峰面積也隨著增加，并在0.5～100.0μg·mL-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的線性方程線性關(guān)系分別為Sguanine=10.3 Cguanine(μg·mL-1)，R=0.999；Sxanthine=21.68 Cxanthine (μg·mL-1)-8.923，R=0.999；Sxanthine= 17.55 Cxanthine (μg·mL-1)-12.593，R=0.999；SAdenine=32.58 CAdenine(μg·mL-1)-3.879，R=0.999。

圖2 嘌呤濃度與HPLC峰面積的關(guān)系 (A)鳥(niǎo)嘌呤，(B)黃嘌呤，(C)次黃嘌呤，(D)腺嘌呤

2.3 HPLC法測(cè)定原位法和傳統(tǒng)法收集細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量比較

見(jiàn)表1～2。

表1 細(xì)胞收集方法對(duì)HPLC峰面積的影響

由表1可見(jiàn)，原位收集的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的峰面積分別為124.6，84.0和157.0，與傳統(tǒng)收集法的峰面積相比，其峰面積分別相對(duì)增長(zhǎng)8.6，6.1和7.4，相對(duì)增長(zhǎng)比例分別為7.4 %，7.8 %和4.9 %。而原位收集的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中鳥(niǎo)嘌呤的峰面積由28.2相對(duì)減少了10.3，其相對(duì)減少的比例達(dá)25.2 %。

表2 HPLC檢測(cè)MCF-7細(xì)胞質(zhì)中嘌呤的濃度

表2描述的是細(xì)胞收集方法對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)嘌呤濃度的影響。結(jié)果表明，原位收集獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)中黃嘌呤，次黃嘌呤，腺嘌呤3種嘌呤濃度均高于傳統(tǒng)收集細(xì)胞法獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)相應(yīng)的嘌呤濃度，但鳥(niǎo)嘌呤濃度低于傳統(tǒng)收集細(xì)胞法獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)，引起這種現(xiàn)象的原因目前還無(wú)法解釋，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究才能確定。

3 結(jié)論

采用HPLC法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤的含量，從次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的峰面積角度考慮，原位收集法>傳統(tǒng)收集法。說(shuō)明與傳統(tǒng)的細(xì)胞收集法相比，原位細(xì)胞收集法更能得到含量較高的嘌呤。

[1]武冬梅, 胡玲, 劉繼光,等. 基于MCF-7細(xì)胞質(zhì)伏安行為的電化學(xué)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)研究 [J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(5): 857-861

[2]D M Wu, G L Fu, L Hu, et al. Studies on the origin of the voltammetric response of the PC-3 cell suspension [J]. Talanta，2009, 78(2): 602-607

[3]J T Wang, X E Li, Y Zhang, et al. Voltammetric behavior of the MCF-7 cell cytoplasm and the effect of taxol on voltammetric response[J].Analytical Biochemistry，2009, 394(2): 229-236

[4]H E Ok, S W Choi, M Kim, et al. HPLC and UPLC methods for the determination of zearalenone in noodles, cereal snacks and infant formula[J].Food Chemistry，2014, 163(22):252-257

[5]C D Lorenzo,A D Santos, F Colombo,et al. Development and validation of HPLC method to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantiumL[J].Food Control，2014,46(12): 136-142

Study of detection of purine cellular by HPLC method

LIUHui-dong1,LIJin-lian2,WUDong-mei2

(1.Heilongjiang Kaituo Radiation Technology Development Company,Haebin 150001，China;2.College of Pharmacy of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To improve the method of cell collection for promotion efficiency of detection purine cellular by HPLC method. Methods: HPLC methodis adopted to detect cytoplasm collected by in situ and traditional methods. Results: The concentrations of xanthine, hypoxanthine and adenine collecting by in situ method were more than that by tradition method. Conclusion: Compared with the tradition collection method, in situ collection method was more effective.

HPLC method; purine; MCF-7 cell

黑龍江省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12511542。

劉慧東(1963～)女，黑龍江哈爾濱人，大專，工程師。

武冬梅(1967～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail:dmwu@jmsu.edu.cn。

R965.2

A

1008-0104(2015)01-0015-02

2014-10-04)