Fractalkine、IP-10及不同信號通路抑制劑對腫瘤微環(huán)境中NK細胞的影響

吳朝真，劉放，李寧，張宏瑤，靳鳳姣，蘭嵐，王悅

Fractalkine、IP-10及不同信號通路抑制劑對腫瘤微環(huán)境中NK細胞的影響

吳朝真，劉放，李寧，張宏瑤，靳鳳姣，蘭嵐，王悅

目的探討Fractalkine(FKN)、干擾素誘導蛋白10(IP-10)以及不同信號通路抑制劑對腫瘤微環(huán)境自然殺傷(NK)細胞數(shù)目和功能的影響。方法免疫組化染色觀察人乳腺癌組織中CD56和DAP10的分布情況。通過共培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW 264.7與小鼠乳腺癌細胞4T1模擬體外腫瘤微環(huán)境(數(shù)目比例1:4)，以小鼠NK細胞KY-1為研究對象。RTPCR檢測腫瘤微環(huán)境中KY-1細胞表面活性受體CD16、NKG2D及NK1.1的表達；ELISA檢測培養(yǎng)細胞上清CD107a的含量。在腫瘤微環(huán)境中加入10ng/ml FKN及10ng/ml IP-10，流式細胞術測定NK1.1+CD16+KY-1細胞的數(shù)量；趨化及黏附實驗評價其遷移和黏附功能的變化。最后，以10nmol/L雷帕霉素、30μmol/L LY294002、500ng/μl穿心蓮內酯、2μmol/L渥曼青霉素分別處理4T1細胞，收集上清分別孵育RAW 264.7細胞48h后，RT-PCR檢測4T1、RAW 264.7 mRNA及兩種混合mRNA中Rae1α、H60a的表達。結果腫瘤微環(huán)境中，KY-1細胞NK1.1+細胞比例、趨化率及黏附功能明顯下降，加入FKN和IP-10后以上各項指標明顯增高，不同信號通路阻滯劑使4T1細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性均有不同程度提高，以雷帕霉素作用最為明顯(P<0.05)。結論FKN、IP-10可上調腫瘤微環(huán)境中NK細胞的數(shù)目和功能，雷帕霉素等通過誘導腫瘤細胞高表達NKG2D配體(Rae1、H60a)，間接促進NK細胞的殺傷活性。

趨化因子CX3CL1；趨化因子CXCL10；信號傳導；殺傷細胞，天然；腫瘤微環(huán)境

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是一群淋巴激活殺傷細胞，對腫瘤細胞(即“種子”)有明確的殺傷作用，而腫瘤微環(huán)境(t u m o r microenvironment，TME)，即“土壤”，可抑制該作用[1]。隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)TME的生物活性具備可調節(jié)性，特別是在腫瘤免疫治療中具備應用潛力[2]。一方面，我們期望改變“土壤”，通過趨化因子上調NK細胞的數(shù)量及其表面具備殺傷功能的活性受體。另一方面，我們以“種子”作為靶點，通過提高腫瘤細胞對NK細胞殺傷的敏感性從而抑制腫瘤生長。

NK細胞表面不乏趨化因子的受體，如C-X3-C趨化因子受體1(C-X3-C chemokine receptor 1，CX3CR1)、C-X趨化因子受體3(C-X chemokine receptor 3，CXCR3)等，其相應配體C-X3-C趨化因子配體1(C-X3-C chemokine ligand 1，CX3CL1，也稱Fractalkine，F(xiàn)KN)和趨化因子IP-10[又稱干擾素誘導蛋白10(interferon inducible protein-10)，IP-10，也稱C-X趨化因子配體3，CXCL3]，因能促進CX3CR1+和CXCR3+的NK細胞在腫瘤局部聚集并能形成有效的抗腫瘤免疫微環(huán)境而引起關注[3-4]。本研究擬觀察KY-1細胞進入TME[5]后數(shù)量和功能的變化，探討發(fā)生此變化是否與微環(huán)境中FKN和IP-10等趨化因子含量的改變相關。NK細胞發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用主要是通過受體-配體特異性識別和結合來完成，其中，NKG2D是最重要的活化性受體之一，NKG2D在小鼠中主要是識別與其類似的視黃酸早期轉錄因子1(Rae1)及組織相溶性抗原60(H60a)[6]。

本研究擬探究四種不同信號通路抑制劑對4T1細胞以及TME中的RAW 264.7中相關的NKG2D配體(NKG2DLs)的表達情況，探索其相關機制，為增強NK細胞免疫功能治療腫瘤奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌組織切片來自天津醫(yī)科大學天津市腫瘤醫(yī)院；兔抗人DAP10抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；小鼠抗人CD56抗體購于中杉金橋生物技術有限公司；小鼠巨噬細胞系RAW264.7和小鼠乳腺癌細胞系4T1細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學系細胞中心；KY-1細胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。100%胎牛血清購自Hyclone公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京康寧公司；FKN、IP-10、RANTES、IL-2等細胞因子均購自美國PeproTech公司；雷帕霉素購自生工生物工程股份有限公司；渥曼青霉素購自碧云天生物技術研究所；穿心蓮內酯購自美國Sigma-Aldrich公司；LY294002購自美國Promega公司；Trizol試劑購自北京鼎國生物技術公司；RT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；RT-PC兩步法試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；小鼠CD107a、FKN及IP-10的ELISA試劑盒購自美國RB公司；FITC標記的抗小鼠CD16和PE標記的抗小鼠NK1.1抗體購自天津三箭生物技術有限公司。

1.2 檢測指標及實驗分組

1.2.1 CD56和DAP10在人乳腺癌組織的分布 取人乳腺癌組織切片，應用免疫組化法，采用蘇木素及DAB染色后觀察CD56和DAP10的分布情況，實驗分為4組：陽性對照組， CD56檢測組，DAP10檢測組和陰性對照組。

1.2.2 TME中NK細胞功能測定

1.2.2.1 TME模擬原理 在24孔板或培養(yǎng)瓶中鋪入RAW264.7細胞，采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入IL-2 (10ng/ml)以及40%小鼠乳腺癌細胞4T1細胞上清共培養(yǎng)，分別模擬不直接或直接接觸的TME。

1.2.2.2 RT-PCR檢測NK細胞活性受體CD16、NKG2D和NK1.1的mRNA表達情況 將KY-1細胞作為檢測對象，實驗分為3組：A組為普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的KY-1細胞(不添加IL-2)，作為對照組；B組為實驗組，在A組的基礎上加用10ng/ml IL-2；C組為模擬TME組，在B組基礎上加用40% 4T1上清孵育KY-1細胞。孵育48h后，提取3組RNA，PCR檢測CD16、NKG2D和NK1.1的表達。

1.2.2.3 ELISA檢測CD107a分泌 以KY-1細胞作為研究對象，分對照組和TME組，在24、48h分別收集上清，采用ELISA法檢測CD107a分泌水平。

1.3 趨化因子FKN及IP-10對TME中NK細胞的數(shù)量及功能的影響

1.3.1 TME中FKN和IP-10含量測定 以KY-1細胞作為研究對象，分對照組和TME組，分別于24、48h收集上清，采用ELISA法檢測FKN和IP-10含量。

1.3.2 FKN和IP-10對TME中NK細胞數(shù)目的影響實驗分3組，A組為TME組，KY-1在模擬TME中進行培養(yǎng)；B、C組分別為TME+FKN組、TME+IP-10組，在A組的基礎上預先用IL-2(10ng/ml) 持續(xù)處理KY-1細胞12h，在TME中添加FKN(10ng/ml)或IP-10(10ng/ml)48h后，用流式細胞術檢測各組中NK1.1+細胞的比例。

1.3.3 FKN和IP-10對TME中NK細胞功能的影響取2×105/ml KY-1細胞作為實驗對象，分9個組：以含40% 4T1上清的培養(yǎng)基單獨或加入以下8種不同的細胞因子單獨或組合配伍(FKN、IP-10、I-TAC、IP-10+I-TAC、CCL5、FKN+IFN-γ、IP-10+IFN-γ及I-TAC+IFN-γ)培養(yǎng)48h。采用趨化實驗檢測細胞的趨化率以反映細胞的趨化活性，采用黏附實驗檢測細胞的黏附功能。

1.4 不同信號通路阻滯劑影響4T1細胞對NK細胞殺傷敏感性檢測 實驗分6個組，分別在正常培養(yǎng)的4T1細胞中加入與實驗組同體積的1%DMSO 和H2O，作為對照旨在觀察藥物稀釋所用溶劑(DMSO)是否對實驗有干擾。收集4T1上清，使用40%4T1上清孵育RAW264.7細胞48h。4個實驗組分別在DMSO組的基礎上，在培養(yǎng)4T1時加入10nmol/L雷帕霉素、30μmol/L LY294002、500ng/μl穿心蓮內酯、2μmol/L渥曼青霉素進行處理。分別提取2個對照組和4個實驗組共6個組中4T1細胞的RNA、RAW264.7細胞RNA以及二者的混合物，采用PCR技術檢測H60和Rae1的表達情況。

1.5 實驗技術

1.5.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞和4T1細胞用含100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。KY-1細胞用含10μmol/L β-巰基乙醇、10ng/ml IL-2、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2 免疫組化 以PBS替代一抗作陰性對照，石蠟包埋和甲醛溶液固定標本，5μm切片，依次行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波抗原修孵育5min、0.3%H2O2孵育20min后，與一抗4℃孵育過夜、TBS洗滌后二抗孵育30min、DAB顯色劑處理5～10min，蘇木素復染1min，并脫水、透明、封固，利用熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)觀察取圖，結果行半定量評估。蛋白主要表達于胞質，胞質染為棕色判定為陽性細胞。

1.5.3 RT-PCR檢測 Trizol法提取總RNA，采用超微量分光光度計測量mRNA濃度，取1μg反轉為cDNA，PCR反應條件為：94℃ 3min；94℃ 30s、50～60℃30s、72℃30s，35～40個循環(huán)；72℃ 5min。引物序列如下：CD16，上游5'-TGACACCCCATCCATCCTAT-3'，下游5'-CCCAGGATCTCACTGGGTTA-3'，退火溫度55℃；NKG2D，上游5'-ACGTTTCAGCCAGTATTG TGC-3'，下游5'-GGAAGCTTGGCTCTGGTTC-3'，退火溫度58℃；NK1.1，上游5'-TTGCTGTTTCCGT CTGTC-3'，下游5'-TTGTCAACCCACCACCTT-3'，退火溫度58℃；Rae1α，上游5'-GCTGTTGCCACAG TCACATC-3'，下游5'-CCTGGGTCACCTGAAGTCA T-3'，退火溫度55℃；H60a，上游5'-GCCTCAACAA ATCGTCAT-3'，下游5'-ATACACCAAGCGAATACC-3'，退火溫度55℃；β-actin，上游5'- CGTTGACATCCG TAAAGACC-3'，下游5'- AACAGTCCGCCTAGAAGC -3'，退火溫度55℃。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查目的片段，應用Band Scan5.0軟件進行分析，實驗重復3次。

1.5.4 流式細胞技術 檢測KY-1細胞計數(shù)達5×105個/ml，在條件培養(yǎng)基中分別加入FKN和IP-10，培養(yǎng)24～48h，使用FITC標記的抗小鼠CD16抗體和PE標記的抗小鼠NK1.1抗體對細胞進行雙染，使用BD FACSCalibur流式細胞儀操作，Cell Quest軟件分析10 000個單細胞樣品。

1.5.5 ELISA檢測 在模擬TME中RAW264.7細胞孵育12h后加入5×105KY-1細胞共培養(yǎng)作為實驗組。不加入4T1上清者作為對照組，取孵育12、24、36、48h的上清液，按ELISA試劑盒步驟行CD107a檢測，在450nm和570nm雙波長光波的分光光度計下讀數(shù)。取培養(yǎng)24、36h的上清液，按照ELISA試劑盒的步驟檢測FKN和IP-10的含量。

1.5.6 趨化實驗 收集細胞培養(yǎng)上清，將KY-1細胞置于5μm孔徑的上室，加入100μl培養(yǎng)基，每組設3個復孔。用24孔趨化池，取600μl含40% 4T1上清的培養(yǎng)基或加入10ng/ml的IP-10/FKN的培養(yǎng)基作為趨化物加入下室，普通RPMI 1640(含10%胎牛血清和雙抗)作為對照。37℃孵育48h后移去上室，收集下室中KY-1的細胞，0.1%結晶紫染色并計數(shù)。趨化率=遷移到實驗組的細胞數(shù)與遷移到對照組細胞數(shù)的差值/總細胞數(shù)×100%。

1.5.7 黏附實驗 4T1細胞以1×104/ml密度單層鋪入6孔板，NK細胞以4×104/ml密度鋪入6孔板，兩種細胞共同孵育過夜，PBS洗去未黏附細胞，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)(放大10×計數(shù)，放大400×取圖)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CD56和DAP10在人乳腺癌組織的分布 蘇木素及DAB染色結果如圖1所示，癌巢中存在一定數(shù)目的CD56+NK細胞，多數(shù)存在于癌巢的基質中。同時也可觀察到DAP10+淋巴細胞多存在于癌周非惡性組織，很少浸潤至癌巢。

2.2 TME中NK細胞功能測定

2.2.1 NK細胞活性受體mRNA表達情況 TME中KY-1細胞表面CD16、NKG2D和NK1.1的mRNA表達水平與對照相比明顯下降(P<0.05，圖2)。

2.2.2 CD107a分泌情況 ELISA結果顯示，TME中KY-1培養(yǎng)上清中CD107a含量在24、48h均明顯低于對照組，僅為對照組的41.2%(P<0.05，表1)。

圖1 人乳腺癌組織CD56和DAP10的分布(蘇木素及DAB染色)Fig.1 Expression and distribution of CD56 and DAP10 in human breast carcinoma (Hematoxylin and DAB staining)A. Positive control; B. CD56 group, square 1 denotes a representative CD56+cell; C. DAP10 group, DAP10+lymphocytes extensively populates the nonmalignant periphery as square 2, whereas fewer of them infiltrates the tumor nest as square 3; D. Negative control

圖2 RT-PCR檢測KY-1細胞CD16、NKG2D、NK1.1 mRNA表達情況(±s，n=3)Fig. 2 Expression of CD16, NKG2D and NK1.1 mRNA in KY-1 cells detected by RT-PCR (±s,n=3) (1)P<0.05

表1 TME對KY-1細胞培養(yǎng)上清中CD107a、FKN及IP-10含量的影響Tab.1 Effects of TME on the contents of CD107a, FKN and IP-10 in supernatants of KY-1 cells

2.3 趨化因子FKN及IP-10對TME中NK細胞數(shù)量及功能的影響

2.3.1 TME中FKN和IP-10含量測定 TME組中FKN和IP-10的含量在24、48h均明顯低于對照組，分別為對照組的27.3%和49.5%(P<0.05，表1)。

2.3.2 FKN和IP-10對TME中NK細胞數(shù)目的影響 流式細胞術檢測結果顯示，TME+FKN組和TME+IP-10組中NK1.1+細胞比例分別為23.04%、24.43%，與TME組(3.99%)比較，NK1.1+細胞比例分別增加了19.05%和20.44%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.3.3 FKN和IP-10對TME中NK細胞遷移和黏附功能的影響 在8種趨化因子單獨或配伍組中，以加入IP-10和FKN時KY-1細胞趨化率有明顯增加(P<0.05)，以加入FKN和FKN+IFN-γ時KY-1細胞黏附功能明顯增強(P<0.05，P<0.01，圖4)。

2.4 不同信號通路阻滯劑影響4T1細胞對NK細胞的殺傷敏感性 以RAW264.7、4T1和兩者混合mRNA作為模板，不同藥物稀釋所用的DMSO或H2O對實驗無影響。雷帕霉素可顯著上調Rae1和H60a的表達，穿心蓮內酯(andrographolidume)的作用其次，而LY294002和渥曼青霉素(woartmannin)對不同細胞的作用不穩(wěn)定(P<0.05，P<0.01，圖5)。

圖3 FKN和IP-10對TME中KY-1細胞數(shù)目的影響Fig. 3 Effects of FKN and IP-10 on the number of KY-1 cells in TME

圖4 FKN和IP-10對TME中NK細胞遷移和黏附功能的影響Fig.4 Effects of FKN and IP-10 on the migration and adhesion of KY-1 cells (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with no stimuli group

圖5 RT-PCR檢測不同通路抑制劑對4T1和(或)RAW細胞及混合細胞Rae1和H60a中mRNA表達的影響(±s，n=3)Fig. 5 Effects of different signaling pathway inhibitors on the expression of Rae1 and H60a mRNA in 4T1 and/or RAW detected by RT-PCR (±s,n=3)No significant difference was found between H2O group and DMSO group. Each experimental group was compared with DMSO group, (1)P<0.05, (2)P<0.01

3 討 論

研究表明，NK細胞須經(jīng)分化成熟、遷移趨化、接觸黏附等一系列過程才能完成殺傷功能[7-9]，但腫瘤局部特殊的微環(huán)境常通過影響以上過程導致腫瘤內浸潤的NK細胞免疫無能[10]，關于如何影響微環(huán)境中NK細胞的功能，使其發(fā)揮抗腫瘤作用，其機制目前尚未完全闡明。

NK細胞表面有許多表面分子標志，常用的NK細胞表型標志是CD56+CD16+CD19–CD3–，根據(jù)CD56分子表達的表面密度可分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，CD56brigh亞群是中間期過渡分化的NK細胞亞型，具備對細胞因子的增殖應答能力，以分泌細胞因子為主，而CD56dim亞群是終末分化的以殺傷功能為主的NK細胞亞群[10]，故CD56可視作檢測NK細胞分化程度的指標。在此實驗中，使用CD56抗體對人的乳腺癌標本切片進行染色標記，應用免疫組化方法在腫瘤組織原位觀察CD56+細胞(NK細胞)的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)癌巢組織NK細胞顯著減少。說明NK細胞很少與靶細胞(癌細胞)直接接觸，也間接表明腫瘤微環(huán)境影響著NK細胞的浸潤和功能，這也提示腫瘤通過局部微環(huán)境反作用于NK細胞以逃避其殺傷。

近年來，除骨髓和外周血外的胸腺、肝臟、淋巴結、脾臟等器官中NK細胞的分化及其遷移特性亦多有研究。人類 CD56brightCD16–NK細胞優(yōu)勢表達CD62L、CCR7、CXCR4以及一系列黏附分子，提示該群細胞易于在次級淋巴組織及非淋巴組織中聚集；而CD56dimCD16+NK細胞高表達CXCR1、CX3CR1以及ChemR23受體，可能是協(xié)助NK細胞被招募至外周炎癥或腫瘤部位的重要機制[10]。

腫瘤微環(huán)境使得腫瘤細胞可以規(guī)避NK細胞的免疫反應[11]，要想有效清除“種子”，不僅需要改變種子的特性，更需要改變腫瘤微環(huán)境。趨化因子在抗腫瘤作用的研究中日益受到重視，多項研究顯示FKN和IP-10具有抗腫瘤作用[3-4]。結合NK細胞的分化及其遷移特性，即高表達CX3CR1、CXCR1 的NK細胞能夠趨化招募至腫瘤局部[10]，在此實驗中，本研究模擬體外腫瘤微環(huán)境模型，加入KY-1細胞孵育，結果顯示在不同細胞因子組合中，IP-10(CXCR1的特異性配體)和FKN(CX3CR1的特異性配體)兩種趨化因子可顯著提高腫瘤微環(huán)境中的NK細胞數(shù)量，使NK細胞趨化率和黏附功能明顯增強，其中FKN有明顯提高NK細胞黏附癌細胞的功能，可能由于其特有的類黏蛋白莖功能域[12]。成熟小鼠NK細胞表達多種細胞標志，如CD122、NK1.1、DX5、NKG2D、CD16、Ly49、CD94/ NKG2A/C/CD11b以及CD43等。其中NK1.1、NKG2D、CD16是主要的活化受體表面分子，本研究顯示微環(huán)境中這3種分子中低表達，而FKN 和IP-10均能有效提高NK1.1+CD16+的NK細胞的比例。

NK細胞活化最重要的信號通路是NKG2DNKG2DLs，郭坤元教授的團隊開創(chuàng)了分子靶向-過繼性細胞免疫治療，這種模式是建立在NK細胞活化性信號通路(NKG2D-NKG2DLs)的生物學特性，尤其是NKG2DLs可調控的基礎上[13]。NK細胞發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用主要是通過受體-配體特異性識別和結合來完成的，NK細胞表面的受體分為抑制性受體和活化性受體兩大類，活化性受體包括天然細胞毒受體(NCRs，主要有NKp30、NKp44)、KLRs(NKG2家族等)、KIRs(DNAM-1家族、SLAMs家族等)、細胞因子受體(IFNα/βR、IL-12R、IL-15R等、膜整合素分子和其他活化受體。其中，NKG2D是最重要的活化性受體之一，NKG2D在人類主要通過識別病毒感染的細胞或腫瘤細胞表面的MICA/B和ULBP1-6發(fā)揮作用，而在小鼠中主要是識別與其類似的Rae1、H60以及最近發(fā)現(xiàn)的小鼠UL16結合蛋白轉錄因子1(Mult1)。有研究報道NKG2D及其配體Rae-1、H60在移植物抗腫瘤效應中起著重要作用[14]。大量研究表明人類NKG2D信號通過DAP10的YxxM基序結合PI3K傳遞活化信號[15-16]，但小鼠腫瘤細胞的調控機制尚未完全闡明。

在此實驗中，我們使用DAP10抗體對人的乳腺癌切片進行染色標記，觀察結果顯示在腫瘤微環(huán)境中，DAP10+NK細胞沒有有效遷移、浸潤和接觸腫瘤細胞，這一方面可能是因為癌巢中缺乏分化成熟的NK細胞，另一方面是因為腫瘤細胞對NK細胞的殺傷敏感性不強。

因此，本實驗以NKG2D-NKG2DLs為靶點，探究四種信號通路阻滯劑對4T1細胞對NK細胞殺傷敏感性的影響[17]。在鼠源NKG2DLs中，我們選擇Rae1和H60a作為代表分子進行研究，并試圖探索不同信號通路阻滯劑的影響，從而進一步了解NKG2D-NKG2DLs活化的具體機制。雷帕霉素抑制mTOR信號通路，穿心蓮內酯抑制NK-B信號通路和MAPK/ERK1/2信號通路，LY294002特異性抑制PI3K尤其是PI3K/AKT信號通路，而渥曼青霉素也是PI3K/AKT1信號通路的阻滯劑，對照研究結果，可初步認為阻斷mTOR、NK-B等均能提高Rae1 和H60a表達，而阻斷PI3K信號通路的LY294002與渥曼青霉素卻出現(xiàn)下調趨勢，這與文獻報道的NKG2D/NKG2DLs信號通路的活化是通過DAP10結合PI3K傳遞活化信號[16]的觀點一致，進而我們可認為NKG2D/NKG2DLs的活化可能是通過PI3K下游的除外mTOR、NK-B以外的其他信號通路完成的。此前的文獻中報道巨噬細胞表達NKG2D[13]，本實驗中在巨噬細胞檢測到NKG2DLs的表達，可能是受到4T1上清馴化的影響，同時不能排除上清中有NKG2DLs的可能性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)趨化因子FKN、IP-10及雷帕霉素、穿心蓮內酯等信號通路抑制劑對NK細胞殺傷腫瘤細胞均有上調作用，對于臨床指導抗腫瘤和過繼性免疫治療都有一定指導意義，但對于各種藥物的協(xié)同作用、具體機制及臨床應用有待進一步研究和闡明。

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Effect of fractalkine, IP-10 and different signal pathway inhibitors on NK cells in the tumor microenvironment

WU Zhao-zhen1, LIU Fang1, LI Ning1, ZHANG Hong-yao1, JIN Feng-jiao1, LAN Lan2, WANG Yue1*
1Department of Immunology, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China
2Department of Integrated Chinese and Western Medicine, Tianjin Cancer Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: wangyue@nankai.edu.cn

, E-mail: wangyue@nankai.edu.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81171975), and the Project of Application Bases and Advanced Technology Research of Tianjin Municipality (15JCYBJC26900)

ObjectiveTo investigate the inducing effects of chemokines [fractalkine (FKN), IP-10]and different signal pathway inhibitors on NK cells in the tumor microenvironment (TME).MethodsImmunohistochemistry was performed using antibodies for CD56 and DAP10 respectively on human breast carcinoma. Murine macrophages (RAW 264.7) and breast cancer cells (4T1) were co-cultivated at a 1:4 ratio to imitate the TME with NK cells (KY-1) set as the object. RT-PCR was used to determine the mRNA expressions of CD16, NKG2D and NK1.1, and the content of CD107a in the supernatants was determined by ELISA. 10ng/ ml FKN and 10ng/ml IP-10 were added into the TME, NK1.1+CD16+KY-1 cells were counted with flow cytometry, migration and adhesion assays were used to assess the related function of KY-1 cells. 4T1 cells were incubated in 10nmol/L of rapamycin, 30μmol/ L of LY294002, 500ng/μl of andrographolide and 2mmol/L of wortmannin, the 4T1 tumor supernatants (TSNs) were harvested separately and used to incubate RAW 264.7 for 48h, then the expressions of Rae1α and H60a mRNA in 4T1, RAW 264.7 and their mixture were determined by RT-PCR.ResultsThe related indicators of KY-1 cells such as NK1.1+number, chemotaxis rate, and adhesion function decreased obviously in TME, and the above indices increased after the addition of FKN and IP-10, and somesignal pathway inhibitors indirectly promoted NK cells' function in TME, and among them rapamycin was the most efficient one (P<0.05).ConclusionFKN and IP-10 may up-regulate the number and function of NK cells in TME, and rapamycin can promote NK cells' killing function by inducing high expression of NKG2DLs (Rae1, H60a) on tumor cells.

chemokine CX3CL1; chemokine CXCL10; signal transduction; killer cells, natural; tumor microenvironment

R743.31

A

0577-7402(2015)07-0547-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.07

2014-11-07；

2015-06-17)

(責任編輯：沈寧)

國家自然科學基金(81171975)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(15JCYBJC26900)

吳朝真，碩士研究生。主要從事腫瘤免疫方面的基礎研究

300071 天津 南開大學醫(yī)學院免疫學教研室(吳朝真、劉放、李寧、張宏瑤、靳鳳姣)；300060 天津 天津醫(yī)科大學天津腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科(蘭嵐)

王悅，E-mail：wangyue@nankai.edu.cn