鍍銀碳纖維在煙粉虱EPG記錄中的應(yīng)用

盧少華， 潘建斌， 宋 熙, 閆鳳鳴

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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鍍銀碳纖維在煙粉虱EPG記錄中的應(yīng)用

盧少華1， 潘建斌2， 宋 熙1, 閆鳳鳴1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為探索新材料，降低昆蟲刺吸電位技術(shù)(Electrical Penetration Graph，EPG)的測試成本，本研究以鍍銀碳纖維為材料，以金絲為對照，在直流刺吸電位儀(DC-EPG)上測試Q型煙粉虱Bemisiatabaci的取食行為，并對波形進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，利用鍍銀碳纖維記錄的EPG波形總體上與金絲的非常類似；分析幾類典型波形可以發(fā)現(xiàn)，與金絲相比，鍍銀碳纖維記錄的pd波相對振幅顯著下降，且pd-Ⅱ亞波的Ⅱ-1和Ⅱ-3部分的頻率顯著增大；E2波電壓水平顯著低于金絲記錄的水平，而兩者記錄韌皮部參數(shù)的相對振幅和頻率以及E1波的電壓水平差異均不顯著。說明鍍銀碳纖維在一定程度上能夠改進(jìn)EPG的記錄結(jié)果，提高波形的精確性，可以在EPG實驗中替代金絲，但在導(dǎo)電性方面尚有改進(jìn)的空間。

刺吸電位技術(shù)；金絲；鍍銀碳纖維；波形；煙粉虱

刺吸電位技術(shù)(Electrical Penetration Graph，EPG)是用于記錄刺吸式口器昆蟲口針在寄主組織中刺探和取食行為電信號變化特征的技術(shù)。主要用于刺吸式口器昆蟲取食和傳毒行為的研究，也用于植物抗蟲機(jī)制的分析、內(nèi)吸性農(nóng)藥的測定、昆蟲取食刺激物或抑制劑的定位等方面的研究[1,2]。這一技術(shù)出現(xiàn)后在實踐中已得到了多次改進(jìn)[3-7]，尤其是將EPG技術(shù)與計算機(jī)聯(lián)用后，明顯擴(kuò)大了EPG的應(yīng)用范圍，提高了分析效率。然而，連接昆蟲與電極之間的導(dǎo)電金絲多年來一直依靠進(jìn)口，且金絲韌性隨著其直徑的減小也逐漸變?nèi)?，在一定程度上制約了EPG的普及和應(yīng)用，因而有必要尋找替代金絲的材料。碳纖維(Carbon fiber)是一種具有較高強(qiáng)度和拉伸模量(Tensile modulus)的材料，它不僅具有碳材料的固有特性，又兼具紡織纖維的柔軟可加工性，是新一代增強(qiáng)纖維。每一根碳纖維由數(shù)千條直徑大約5～8 μm的更微小碳纖維組成[8]。銀具有導(dǎo)電性好、抗氧化能力強(qiáng)、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點[9]，相對于進(jìn)口金絲，銀的價格相對較低。因此，本研究利用鍍銀碳纖維代替金絲粘連昆蟲，通過EPG記錄進(jìn)行對比，試圖獲得更為精確的EPG波形和更廉價的導(dǎo)電金絲替代品，為深入研究刺吸式口器昆蟲取食行為，特別是為傳毒機(jī)理研究所需要的波形精細(xì)變化做出一定的探索嘗試。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃瓜CucumissativusL.,cv品種為綠劍一號，在光周期L16∶D8；溫度(28±0.5)℃；相對濕度(75±0.5)%的溫室中培養(yǎng)。當(dāng)黃瓜長至3～4片真葉時用于試驗。Q型煙粉虱Bemisiatabaci在室內(nèi)飼養(yǎng)籠(60 cm×40 cm×80 cm)內(nèi)的黃瓜(品種為綠劍一號)上標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)多年，定期用mtCOI標(biāo)記檢測煙粉虱種群的生物型純度[10,11]。EPG測定時隨機(jī)選取新羽化的煙粉虱雌性成蟲用于試驗。

導(dǎo)電金絲(直徑12.5 μm)購自荷蘭瓦赫寧根大學(xué)；碳纖維(單根纖維絲直徑5～8 μm)購于日本東麗株式會社，化學(xué)鍍銀試劑均為市售化學(xué)純。

1.2 碳纖維鍍銀

將碳纖維通過去膠、除油、粗化、敏化和活化后，放入銀鹽溶液中進(jìn)行化學(xué)鍍銀[12,13]。銀鹽溶液：硝酸銀(AgNO3)3.5 g，氨水(NH3·H2O)5 mL，蒸餾水60 mL，氫氧化鈉(NaOH)2.5 g；還原劑溶液：葡萄糖(C6H12O6)45 g，酒石酸(C4H6O6)4 g，乙醇(CH3CH2OH)100 mL，蒸餾水1 L[14,15]。以上2種反應(yīng)液均現(xiàn)用現(xiàn)配。鍍覆完成后用去離子水清洗碳纖維絲，自然晾干。

1.3 EPG記錄

試驗分別用鍍銀碳纖維和金絲作為導(dǎo)電材料。在進(jìn)行EPG測定前，測量鍍銀碳纖維和金的電阻(導(dǎo)電性)，分別為14.2 Ω·cm-1和1.6 Ω·cm-1。導(dǎo)電銀膠為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)生態(tài)實驗室配制(專利授權(quán)號ZL201010610889)。

測定EPG時，取1.5～3.0 cm長的鍍銀碳纖維或金絲用導(dǎo)電銀膠粘連到煙粉虱的前胸背板上，將粘連好的煙粉虱饑餓20 min，隨機(jī)選取活力較強(qiáng)的個體放在黃瓜葉片的背面取食[16]。EPG探頭攝取電信號通過放大器放大后，由A/D轉(zhuǎn)換器收集并轉(zhuǎn)換，再經(jīng)Windaq軟件(DATAQ instruments)在電腦上顯示波形。每次記錄均使用新的植物和煙粉虱，試驗持續(xù)記錄6 h。所有的試驗均在溫度(28±0.5)℃、相對濕度(70±0.5)%、光照良好的法拉第籠(屏蔽環(huán)境中電磁干擾)中完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對所記錄的Pd波、E1波和E2波的電壓水平、相對振幅、頻率等進(jìn)行分析。其中Pd波(胞內(nèi)刺探波，Intracellular penetration)表示昆蟲口針刺入組織細(xì)胞并從中抽樣取食的過程，E1波(韌皮部唾液分泌波，Phloem salivation phase)表示昆蟲口針在韌皮部篩分子內(nèi)部分泌唾液的行為，E2波(韌皮部取食波，Phloem ingestion phase)表示昆蟲被動吸食韌皮部汁液的行為，相對振幅以整個波形最高振幅為100進(jìn)行折算[17]，頻率為每秒波動的次數(shù)。

使用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用多重比較Tukey’s新復(fù)極差法對2個處理進(jìn)行比較分析，差異性顯著水平設(shè)置為P<0.05或P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 整體波形對比

比較鍍銀碳纖維和金絲記錄煙粉虱在黃瓜上的取食波形可以發(fā)現(xiàn)，兩者記錄的DC-EPG波形非常相似(圖1-A，圖1-B)。煙粉虱在黃瓜葉片上的非刺探波與基線重疊，波動頻率為零；刺探波頻率類似，均為正壓，但與金絲記錄波形相比，鍍銀碳纖維記錄的波形振幅相對較?。话麅?nèi)刺探波(pd)和韌皮部取食波(E1波和E2波)變化相似，均為負(fù)壓。

A. 金絲記錄的波形; B. 鍍銀碳纖維記錄的波形; C. 金絲記錄的pd波; D. 鍍銀碳纖維記錄的pd波; E. 金絲記錄的E1波; F. 鍍銀碳纖維記錄的E1波; G. 金絲記錄的E2波; H. 鍍銀碳纖維記錄的E2波。

A. Waveforms recorded with gold wire; B. Waveforms recorded with silver plated carbon fiber; C. pd waveform recorded with gold wire; D. pd waveform recorded with silver plated carbon fiber; E. E1 waveform recorded with gold wire; F. E1 waveform recorded with silver plated carbon fiber; G. E2 waveform recorded with gold wire; H. E2 waveform recorded with silver plated carbon fiber.

圖1 鍍銀碳纖維和金絲記錄的Q型煙粉虱EPG波形比較
Fig.1 DC-EPG waveforms of Q biotypy Bemisia tabaci recorded by using silver-plated carbon fiber and gold wire

2.2 pd波比較

鍍銀碳纖維記錄的pd波相對振幅較金絲記錄的顯著低(鍍銀碳纖維電壓為7.50 V，金絲電壓為9.74 V；P=0.011)，而兩者記錄波形的頻率差異不顯著(鍍銀碳纖維頻率為16.42 Hz，金絲頻率為13.81 Hz；P=0.060)。pd波又分為pd-Ⅰ亞波、 pd-Ⅱ亞波和 pd-Ⅲ亞波，其中負(fù)壓亞波pd-Ⅱ又分為Ⅱ-1、Ⅱ-2和Ⅱ-3。圖1(圖1-C，圖1-D)中pd亞波相比，鍍銀碳纖維記錄波形的相對振幅較金絲的均顯著低；而除了Ⅱ-2亞波，鍍銀碳纖維記錄波形頻率較金絲記錄的均顯著高(P<0.05)。除此之外，鍍銀碳纖維記錄的pd波(pd、Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3)電壓水平較金絲記錄的均極顯著低(P=0.002)。

表1 使用金絲和鍍銀碳纖維所獲得的DC-EPG波形特征比較Table 1 Characteristics of DC-EPG waveforms with gold wire and silver-plated carbon fiber

注：相對振幅是以完整波形最高振幅為100計算；頻率為每秒波動次數(shù)；*表示顯著性差異(Tukey’s testP<0.05)，** 表示極顯著性差異(Tukey’s testP<0.01)。

Note：Relative amplitude was calculated by the maximum amplitude of whole waveform as 100; rate (Hz) was the frequency of wave numbers per second; * and ** indicate significant difference at level ofP<0.05 andP<0.01(Tukey’s test), respectively.

2.3 E波比較

鍍銀碳纖維記錄E波(E1，E2)的相對振幅和金絲記錄的差異均不顯著(P>0.05)。兩者記錄的E1波電壓水平差異不顯著(鍍銀碳纖維電壓為0.33 V，金絲電壓為0.76 V；P>0.05)，但鍍銀碳纖維記錄的E2波電壓水平顯著低于金絲的記錄(鍍銀碳纖維電壓為0.22 V，金絲電壓為0.73 V；P<0.05)。

3 討論

刺探行為是刺吸式口器昆蟲選擇寄主的重要活動，刺探過程是從昆蟲口針與植物表面的接觸開始，最后穿刺到達(dá)韌皮部取食。EPG波形可以反映出刺吸式口器昆蟲對寄主植物的接受程度[18]。使用鍍銀碳纖維記錄煙粉虱在黃瓜上的取食波形顯示，其波形頻率較金絲記錄水平有所提高，而振幅和電壓水平相對較低，這可能是鍍銀碳纖維的電阻值(14.2 Ω·cm-1)大于導(dǎo)電金絲的電阻值(1.6 Ω·cm-1)所致，有待進(jìn)一步探明。

昆蟲介體傳播植物病毒與其取食過程中口針刺破細(xì)胞膜的行為有關(guān)[19,20]。由于介體傳毒時必須將病毒分泌到植物的活細(xì)胞內(nèi)病毒才能存活，同時昆蟲獲取病毒亦需要從細(xì)胞或韌皮部吸食時進(jìn)行，因此，穿刺細(xì)胞的pd波和韌皮部波形(E1波和E2波) 對非持久性病毒的傳播尤為重要。POWEL[21]發(fā)現(xiàn)pd波的出現(xiàn)與桃蚜成功傳播馬鈴薯 Y 病毒有關(guān)。pd 波是昆蟲在植物表皮層細(xì)胞的試探性取食時刺破細(xì)胞膜而產(chǎn)生的，pd波又可分為pd-Ⅰ、pd-Ⅱ和 pd-Ⅲ共3個部分，其中 pd-Ⅱ亞波又可細(xì)分為Ⅱ-1、Ⅱ-2和Ⅱ-3，pd-Ⅱ亞波與介體獲毒和接種病毒有關(guān)，蚜蟲的獲毒過程發(fā)生在 pd-Ⅱ亞波的Ⅱ-3階段(取食) ，接種病毒過程發(fā)生在Ⅱ-1和Ⅱ-2階段(分泌唾液)[19,21]。因此，利用鍍銀碳纖維獲得精確度更高的波形，將有助于深入研究介體的傳毒過程。鍍銀碳纖維和金絲記錄的pd波，尤其是pd-Ⅱ亞波的波形相似度很高，而鍍銀碳纖維記錄的波形頻率有所提高，振幅卻相對較小(表1)。但這并不影響對pd波形的分析。LIU等[22]發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱在帶毒植物上有更多的取食行為。JIANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱傳播番茄花葉病毒病的效率與E1波出現(xiàn)的次數(shù)和E1波持續(xù)的時間有關(guān)，帶毒煙粉虱的刺探次數(shù)和E1波持續(xù)時間明顯增多。利用改進(jìn)后的EPG波形進(jìn)行介體傳播植物病毒與取食行為關(guān)系的研究，通過分析更為精確的波形，可能會更加有助于闡明介體的傳毒機(jī)理。

碳纖維不但具有很高的強(qiáng)度和拉伸模量，還有很強(qiáng)的柔韌性。相對于使用金絲，用鍍銀碳纖維粘連的煙粉虱能更加自由地活動，也就是使用鍍銀碳纖維對昆蟲限制較小，EPG所記錄的取食行為更能夠反應(yīng)實際情況。在昆蟲的粘接過程中，導(dǎo)電絲端部銀球的大小、形成難易程度，對試驗順利進(jìn)行至關(guān)重要。而鍍銀碳纖維相對導(dǎo)電金絲端部能更好地形成銀球，較容易粘連昆蟲，這可能與鍍銀材料表面較為粗糙有關(guān)。試驗證明，使用鍍銀碳纖維粘連昆蟲能提高試驗效率，同時有助于初學(xué)者掌握粘連昆蟲的技巧。目前使用鍍銀碳纖維在一定程度上改善了EPG波形的精確度，提高了試驗的效率，但導(dǎo)電性還是相對較低，需要加以改進(jìn)才能推廣應(yīng)用，比如，還有一些化學(xué)鍍銀工藝需要優(yōu)化，如控制化學(xué)鍍銀過程的溫度和時間，銀鹽溶液和還原劑溶液的用量，提高鍍層結(jié)合力和均勻性等。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

Application of silver-plated carbon fiber in the electrical penetration graph recordings ofBemisiatabaci

LU Shaohua1， PAN Jianbin2, SONG Xi1, YAN Fengming1

(1.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.College of Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to explore possible application of the cheaper, new material in Electrical Penetration Graph (EPG) experiments, in this study, waveforms of Q biotypeBemisiatabacifeeding behavior in direct-current electrical penetration graph (DC-EPG) were recorded and compared by parallel using of the silver-plated carbon fiber and the golden wire. The results showed that the EPG-recorded waveforms with silver-plated carbon fiber were almost similar to those with golden wire. By comparatively analyzing typical waveforms, it is found that the waveforms with silver-plated carbon fiber had lower relative amplitude than those with the golden wire.Ⅱ-1 and Ⅱ-3, sub-waveforms of waveform potential drops (pd), differently higher frequency was observed. The waveform E2 in recordings using silver-plated carbon fiber had significantly lower voltage levels compared with those recordings with golden wire, but for waveform E1, there were no significant differences in relative amplitudes, frequencies and the voltage levels between both recordings. The results indicated that silver-plated carbon fiber could be used to replace gold wire in the EPG recordings to obtain more precise waveforms, but there is still some space for improvement of the electrical conductivity.

EPG; golden wire; silver-plated carbon fiber; waveforms;Bemisiatabaci

2014-11-03

國家自然科學(xué)基金項目(31471776)

盧少華(1988-)，男，河南周口人，碩士研究生，主要從事煙粉虱傳毒機(jī)理研究。

閆鳳鳴(1962-)，男，河南商丘人，教授，博士研究生導(dǎo)師。

1000-2340(2015)02-0229-05

Q967

A