摩西球囊霉菌對Pb脅迫下煙草解毒效應的研究

趙曉改，王 浩，高 杉，袁祖麗

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

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摩西球囊霉菌對Pb脅迫下煙草解毒效應的研究

趙曉改，王 浩，高 杉，袁祖麗

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

以煙草(NicotianatabacumL．)品種中煙100為材料，采用盆栽試驗，研究Pb脅迫下接種與未接種摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，GM)對煙草的形態(tài)變化、葉綠素含量、菌根侵染率、球囊霉素(GRSP)含量、Pb含量(包括土壤殘留、根、煙葉和球囊霉素中)等的影響，以探討Pb脅迫下GM對煙草的解毒效應。結(jié)果表明，接種GM后葉片變綠；葉綠素a(Cht a)和葉綠素b(Chl b)含量升高，Chl a/Chl b值顯著升高；接種GM后菌根侵染率為32.72%和26.17%，顯著地提高了GRSP含量；與同質(zhì)量分數(shù)Pb脅迫未接種組相比，接種GM后根和土壤中殘留Pb含量顯著增加，而煙葉中Pb含量極顯著減少，且下部葉>中部葉>上部葉。

Pb；摩西球囊霉菌；煙草；解毒能力

全世界每年平均排放鉛(Pb)約500 t[1]，中國受Pb、鎘(Cd)等重金屬污染的耕地面積近2 000萬hm2，約占總耕地面積的1/5[2]。重金屬主要通過植物根部進入植物體內(nèi)，在英國合法購買的香煙煙葉中Pb質(zhì)量分數(shù)為0.4～0.9 mg·kg-1，而中國市場上常見香煙中Pb的質(zhì)量分數(shù)為4.48 mg·kg-1[3，4]，因此降低中國煙葉中重金屬的含量已成為提高煙葉品質(zhì)的關鍵[5]。摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，GM)為叢枝真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi , AMF)的一種，它能夠增加植物根部吸收面積，促進作物生長。球囊霉素(Glomalin related soil protein，GRSP)是AMF分泌的一種糖蛋白，這種物質(zhì)能夠吸附土壤中的重金屬，減少重金屬對植株的毒害[6]，并增加植株耐干旱及病害之能力[7]。叢枝真菌可提高楊樹[8]、黃芪[9]、小麥、大豆[10]和番茄[11]等植物的抗逆脅迫，而GM對Pb脅迫下煙草的解毒效應目前尚未見報道，因此，本研究以煙草中煙100為材料，根據(jù)文獻[12]的標準，研究了不同質(zhì)量分數(shù)Pb污染下，未接種與接種GM對煙草的形態(tài)、葉綠素含量、根系的侵染率、球囊霉素含量及Pb含量(包括：土壤殘留、根、煙葉和球囊霉素中)的影響，探討GM對煙草中Pb毒性的解除效應，為提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

1.1.1 試驗材料 試驗材料為煙草(NicotianatabacumL.)中煙100(原品系CF965)，由河南省農(nóng)科院煙草研究中心提供。叢枝真菌為摩西球囊霉菌(Glomusmosseae),由北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所的中國叢枝菌根真菌種質(zhì)研究庫提供。供試土壤為許昌市農(nóng)田耕作表層土，土壤性質(zhì)為壤質(zhì)潮土，pH值為6.94；Pb本底值為22.74 mg·kg-1；有機質(zhì)含量為14.38 g·kg-1；全氮和堿解氮為0.65 g·kg-1和45.81 mg·kg-1；全磷和速效磷為0.89 g·kg-1和20.42 mg·kg-1；全鉀和有效鉀分別是19.6 g·kg-1和238 mg·kg-1。裝盆前土壤過篩，每盆裝干土15 kg(盆缽直徑36 cm，深42 cm)。為了防止重金屬滲漏，在盆外套上塑料袋。施用化肥分別為 (NH4)2SO4、KH2PO4、KNO3(均為分析純)，肥料均作基肥1次性施入。施N量按0.45 g·kg-1干土施用，氮、磷、鉀比例為m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=16∶14∶15。

1.1.2 試驗設計 試驗設計為0、200(未接種)、200(接種GM)、400(未接種)和400(接種GM)mg·kg-1Pb。

1.1.3 試驗處理 采用漂浮育苗的方法，取長勢一致的煙苗(6片煙葉)，2013-05-06移栽，每盆移栽煙苗1株。移栽返苗7 d后，按照試驗設計濃度將Pb(NO3)2溶解于1 000 mL蒸餾水中，以污灌的方式一次性施入，每個處理重復3次，管理同一般大田。

1.2 測定內(nèi)容及方法

1.2.1 煙草形態(tài)變化 在接種處理后的60 d，分別觀察記錄煙草的形態(tài)變化。

1.2.2 葉綠素含量的測定 取接種處理60 d后的成熟煙葉片(自上而下的第4片葉)，采用文獻[13]的方法測定葉綠素含量。

1.2.3 根系菌根侵染率的測定 取3級側(cè)根的根毛為試驗材料(1 cm)，將材料迅速放入FAA固定液中V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(乙醇)=13∶5∶100，采用墨水染色觀察法測定根系菌根侵染率。處理好的根段放在載玻片上，每個載玻片上放3根，根段與載玻片的短軸平行，滴上一滴甘油，放蓋玻片，在10×10倍的視野下觀察，根據(jù)根段侵染數(shù)量或程度分為0 ，10% ，20% ，30% ，…，100%侵染等級，依下列公式計算該樣品菌根侵染率：侵染率(%)= ∑(0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+…+100%×根段數(shù))/觀察總根段數(shù)[14]。

1.2.4 球囊霉素(GRSP)含量及球囊霉素中Pb含量的測定 取根部周圍10 cm、深度分別為5、10、15、20 cm)處的土壤，參照文獻[15]的方法提取GRSP，GRSP含量的測定參照文獻[16]的方法。GRSP中Pb含量的測定：取GRSP提取液10 mL，用電感耦合等離子體(ICP-MS) XSERISE2型高效液相色譜儀測定(方法編號：DD2005-01)。

1.2.5 根、煙葉及土壤中Pb含量的測定 在采收期分別取各處理的根(根毛區(qū)及以下根段)、下部煙葉(自下向上3和4片)、中部煙葉(自下向上7和8片)、上部煙葉(自下向上11和12片)和根際周圍不同深度(5、10、15、20 cm)的土壤。將材料置于烘箱中80 ℃烘干72 h，分別取烘干磨碎(過40目篩)的煙根、煙葉及土壤0.500 g, 用上述高效液相色譜儀測定(方法編號：DD2005-01)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 以上每項試驗重復測定3次，數(shù)據(jù)采用DPS V7.05進行單因素統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb脅迫下接種GM對煙草形態(tài)的影響

圖1表明，Pb含量200 mg·kg-1脅迫下，造成煙草葉片輕微變黃，而Pb含量400 mg·kg-1脅迫下，煙草葉片顯著變黃，接種GM后煙草在形態(tài)上呈現(xiàn)生長健康狀態(tài)。因此，從形態(tài)上可以看出，接種GM后會對Pb脅迫起到一定的修復作用。

A．對照；B．200未接種；C 200接種；D．400未接種；E．400接種.A．contrast；B．200 inoculation；C 200 uninoculation；D．400 inoculation；E．400 uninoculation.

2.2 Pb脅迫下接種GM對煙草葉片葉綠素含量的影響

由表1可知，Pb脅迫下的煙草與對照(未施入Pb和GM)相比，施入Pb的煙草葉片Chl a、Chl b、Chl (a+b)和Chl a/Chl b值均不同程度降低，說明施入Pb后，煙草葉片中與光合作用密切相關的葉綠素合成受阻或受到破壞。200(未接種)和200(接種GM)相比，Chla、Chlb、Chl(a+b)和Chla/Chlb值均不同程度下降，降低幅度分別為：22.46%、19.05%、21.56%和2.86%； 400(未接種)和400(接種GM)相比，降低幅度分別為：30.37%、25.00%、28.86%和4.30%。其中的Chl a含量下降達到極顯著水平(P<0.01)，Chlb和Chl(a+b)含量下降達到顯著水平(P<0.05)。

表1 Pb脅迫下接種GM對煙草葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effect of inoculation with GM on chlorophyll content in tobacco leaves under Pb stress

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

Note: lower-case letters show the significant difference at 0.05 level. The same as below.

2.3 GM對煙草根系侵染率

對各處理煙草根系菌根侵染率的研究(圖2)表明，未接種GM的煙草未檢測到其根系有菌根侵染，而接種GM與施入同質(zhì)量分數(shù)Pb的煙草相比，200、400 mg·kg-1Pb與200接種，400接種根系菌根侵染率分別為32.72%和26.17%。

A：對照；B：200未接種；C：200接種；D：400未接種；E：400接種。A．contrast；B．200 inoculation；C.200 uninoculation；D．400 inoculation；E．400 uninoculation.

2.4 Pb脅迫下接種GM對煙草根際土壤中GRSP含量及GRSP中Pb含量的影響

由表2可知，對照、Pb脅迫下(200和400)未接種GM的根際土壤中GRSP含量分別為15.40、14.03、14.50 mg·kg-1，而Pb脅迫下(200和400)接種GM根際土壤中GRSP含量達到了406.00、452.67 mg·kg-1，與未接種相比分別增加了28.93和31.22倍；對照、Pb脅迫下( 200和400)未接種GM的根際土壤GRSP中Pb的含量分別為656.51、1 672.98和2 488.57 ng·g-1，而Pb脅迫(200和400)下接種GM根際土壤GRSP中Pb的含量分別為3 331.67、8 939.84 ng·g-1，比未接種增加了1.99和3.59倍。

表2 Pb脅迫下接種GM對煙草根際土壤中GRSP含量及GRSP中Pb含量的影響Table 2 Effect of inoculation with GM on GRSP content and Pb content in GRSP in tobacco rhizosphere soil under Pb stress

2.5 Pb脅迫下接種GM對煙草煙葉、根及土壤殘留的影響

表3顯示，Pb脅迫下(200和400)，煙草接種GM與未接種相比，根系中Pb含量分別增加了72.76和73.4 mg·kg-1；土壤殘留中Pb含量分別增加了31.67和51.06 mg·kg-1；下部煙葉中Pb含量分別減少了1.52和3.55 mg·kg-1；中部煙葉分別減少了1.56和1.50 mg·kg-1；上部煙葉分別減少了1.64和1.00 mg·kg-1，和未接種組煙葉中Pb含量相比，接種GM后，葉片中Pb含量顯著減少，不同處理下葉片中Pb含量為下部葉>中部葉>上部葉。

表3 Pb脅迫下接種GM對煙草煙葉、根及土壤中Pb含量的影響Table 3 Effect of inoculation with GM on Pb concentration in leaves, roots and rhizosphere soil

3 討論

雖然Pb是植物的非必需元素，但很容易被植物吸收，且多數(shù)積累在根系，僅少量進入地上部[18]，本研究結(jié)果與PATRA等的研究結(jié)果一致。葉綠體不僅是植物光合作用的場所，也是細胞中對重金屬最敏感的細胞器[19]，過量的Pb能導致葉綠體基粒垛疊結(jié)構(gòu)的解體及與片層結(jié)構(gòu)有關的基質(zhì)明顯減少，且Pb在植物體內(nèi)還可能與酶蛋白的-SH基或其它側(cè)鏈結(jié)合，取代Fe、Mg、Zn等離子，抑制包括葉綠素酸酯還原酶在內(nèi)的一系列與葉綠素合成有關的酶活性，如δ-氨基乙酰丙酸脫水酶的活性[20]。而接種GM后，煙葉呈現(xiàn)健康生長狀態(tài)，葉綠素含量升高，這與王曉敏等[21]研究一致，可能是接種GM后，葉片中Pb含量降低，從而減小了Pb對葉綠體的破壞或降低了Pb對煙草葉綠素合成的阻礙。

土壤中80%以上的GRSP緊密地結(jié)合在根外菌絲和孢子上，與菌絲壁形成一些難溶性的復合物或松散地陷入菌絲壁，阻止重金屬向上轉(zhuǎn)移[24]，接種GM后，一方面，根際土壤中GRSP含量顯著增加，GRSP螯合大量的Pb于根際，土壤中Pb的生物有效性大大降低，使煙葉呈健康生長狀態(tài)。另一方面，隨著菌絲對根系的侵染，根系內(nèi)GRSP結(jié)合Pb的含量增加，造成根系Pb含量增加，使得接種組煙葉各部分Pb含量(下、中和上葉)顯著低于未接種組，且下部葉>中部葉>上部葉。研究結(jié)果，顯示接種GM可降低Pb污染地區(qū)煙葉中Pb含量。

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(責任編輯：朱秀英)

Effects of inoculation withGlomusmosseaeon toxicity in tobacco under Pb stress

ZHAO Xiaogai，WANG Hao，GAO Shan，YUAN Zuli

(College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Taking tobacco (NicotianatabacumL.) cultivars smoke 100 as the material, a pot experiment, researchers inoculated with Glomus fungal (Glomusmosseaereferred to as GM) was conducted to improve the ability to influence the toxicity of Pb in Pb stress. Vaccinated with unvaccinated morphological changes in tobacco, chlorophyll, mycorrhizal infection rate, the glomalin (GRSP) content, Pb content (residual soil, roots, tobacco and glomalin) and other studies were carried out to investigate the GM for physiological and ecological characteristics of tobacco plants affected. The results showed that GM tobacco leaf morphology after inoculation grown green chlorophyll a (Cht a) and chlorophyll b (Chl b) content increased, the value of Chl a/Chl b increased significantly; clump planting fungal inoculation significantly increased the mycorrhizal invasion tobacco, root, group compared with the soil residual Pb content with the same mass concentration unvaccinated, roots, soil residual Pb content increased significantly, significantly reducing to baccoPb content, and the lower leaves> middle leaves>; dye uptake and GRSP content in upper leaves. GRSP indicate chelation of Pb resulted in a significant reduction of Pb content in the soil and roots, making tobacco Pb content decreased significantly.

Pb；Glomusmosseae；tobacco；detoxification

2014-06-20

河南省科技廳基礎前沿項目(142300410152)

趙曉改(1987-)，女，河南禹州人，碩士研究生，主要從事煙草重金屬方面的研究。

袁祖麗(1963-)，女，河南鄭州人，教授，博士。

1000-2340(2015)02-0153-05

S572

A