謝貴元,關(guān) 嵐,劉新民,王 安
(1.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,長沙 410078;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科,長沙 410007)
苦參堿(matrine)是由中草藥植物苦參的根、植株、果實(shí)經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成的天然植物性農(nóng)藥,其主要成分有多種生物堿,以苦參堿、氧化苦參堿含量最高[1]??鄥A原藥大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮 LD50均>5000mg/kg.bw,對(duì)動(dòng)物和魚類安全,為低毒廣譜殺蟲劑,具有觸殺和胃毒作用,對(duì)各種作物上的黏蟲、菜青蟲、蚜蟲、紅蜘蛛等有明顯的防治效果[2-3]??鄥A急性毒性的研究已有部分報(bào)道,但有關(guān)苦參堿的致突變作用研究少有報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3%苦參堿水劑的致突變作用進(jìn)行了較為全面的研究,為苦參堿農(nóng)藥的生產(chǎn)和安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 受試物 3%苦參堿水劑,由國內(nèi)某農(nóng)藥生產(chǎn)廠家生產(chǎn)。樣品為褐色粘稠液體,不溶于水,實(shí)驗(yàn)時(shí)用食用調(diào)和油配制。
1.1.2 受試動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠,體重25.0g ~30.0g,由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0012。
1.1.3 受試菌株、細(xì)胞株、細(xì)胞 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變菌株(TA97、TA98、TA100和TA102),由中國藥物研究所提供;L5178Y3.7.2c-tk+/-細(xì)胞(小鼠淋巴瘤細(xì)胞株),購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;人外周血淋巴細(xì)胞取自健康成人。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》(GB15670-1995)[4]進(jìn)行。Ames試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法;微核試驗(yàn)采用30 h兩次給藥法;體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因(TK位點(diǎn))突變試驗(yàn)采用96孔平板法;體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)采用微量外周血培養(yǎng)法。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行資料統(tǒng)計(jì)分析,微核率用泊松分布,u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,小鼠淋巴瘤細(xì)胞株(L5178Y)TK基因突變試驗(yàn)和染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間均數(shù)比較,P≤0.05,表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 Ames試驗(yàn) 如表1、2所示,受試物各劑量組對(duì)試驗(yàn)菌株在加與不加S-9代謝活化系統(tǒng)條件下,回復(fù)突變數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)的2倍,且無劑量-反應(yīng)關(guān)系,Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
表1 3%苦參堿水劑鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果
表2 3%苦參堿水劑鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果
2.1.2 微核試驗(yàn) 各組骨髓多染紅細(xì)胞(PCE)微核率見表3,陰性對(duì)照組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為1.4‰和2.0‰。3%苦參堿水劑各劑量組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為0.8‰~1.6‰和1.0‰~2.0‰,與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。陽性對(duì)照組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率均為25.6‰,與陰性對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果表明,3%苦參堿水劑不引起小鼠骨髓多染紅細(xì)胞染色體斷裂或整條染色體丟失。
2.1.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因(TK位點(diǎn))突變試驗(yàn)各劑量組PE0、PE2及MF集落孔數(shù)見表4,各組PE0、PE2、RS%及MF計(jì)算值見表5。由表4可知,在加與不加S9mix條件下,各劑量組MF與其溶劑對(duì)照組比較,差別無顯著性(P>0.05)。陽性對(duì)照組(CP和MMS)MF與其溶劑對(duì)照組比較,差別有極顯著性(P<0.01)。結(jié)果表明,3%苦參堿水劑未引起細(xì)胞突變頻率增高。
2.1.4 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn) 由表6可見,在加S9mix與不加S9mix的條件下,溶劑對(duì)照組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為1.5%和2.0%。3%苦參堿水劑各劑量組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為2.0%~3.0%和1.0%~2.5%,與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較,差別均無顯著性(P>0.05)。陽性對(duì)照組(CP和MMS)人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為13.0%和11.5%,明顯高于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明,3%苦參堿水劑不會(huì)引起人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率增高。
表3 3%苦參堿水劑對(duì)小鼠骨髓微核發(fā)生率和PCE/NCE比值的影響
表4 3%苦參堿水劑各劑量組培養(yǎng)板集落孔數(shù)
表5 3%苦參堿水劑體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)結(jié)果
表6 3%苦參堿水劑對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率的影響
苦參堿廣泛存在于豆科槐屬植物苦參、苦豆子及廣豆根中,具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心律失常和免疫調(diào)節(jié)等功能[9-10],在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中苦參堿對(duì)菜青蟲、粘蟲、白菜蚜等多種農(nóng)業(yè)害蟲具有毒殺活性[2-3]。張宏利等[11]應(yīng)用從苦參中分離到苦參堿單體,以小白鼠進(jìn)行毒性測定表明:苦參堿單體對(duì)小鼠的LD50為64.01mg/kg·wb。王曉燕等[12]研究發(fā)現(xiàn) :經(jīng)腹腔注射純度≥99%的苦參堿,其LD50為157.13mg/kg·wb。體外實(shí)驗(yàn)表明苦參堿有較強(qiáng)的殺精子作用[13-14],在一定程度上有遺傳毒性作用[15]。
致突變試驗(yàn)通常采用反映基因突變、體細(xì)胞突變和反映遺傳危害(生殖細(xì)胞突變)的配套試驗(yàn)來檢測外來化合物的誘變性。本實(shí)驗(yàn)采用微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因(TK位點(diǎn))突變試驗(yàn)及體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)檢測3%苦參堿水劑的誘變性。研究結(jié)果顯示:在加與不加S-9代謝活化系統(tǒng)條件下,給予鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變菌株1250~5000μg/皿劑量受試物,其回復(fù)突變數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)的2倍,且無劑量-反應(yīng)關(guān)系。雌、雄鼠以97.5~1580mg/kg劑量受試物染毒,各劑量組的微核率與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異,不引起小鼠骨髓多染紅細(xì)胞染色體斷裂或整條染色體丟失。L5178Y TK+/--3.7.2C細(xì)胞給予25~200mg/kg劑量受試物,各劑量組MF與其溶劑對(duì)照組比較,差別無顯著性(P>0.05),未引起細(xì)胞突變頻率增高。給予77.81μg /mL、156.2μg/mL、312.5μg /mL劑量的受試物,各劑量組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較,差別均無顯著性。
結(jié)果表明:在本實(shí)驗(yàn)條件下,3%苦參堿水劑未見致突變作用。
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