黃芪湯劑對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎組織中Smad4表達(dá)的影響

楊 智，金 一，沙小松 ，鐘 維 ，彭耀銘，金 紅

（1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2. 湖南師范大學(xué)樹達(dá)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，長(zhǎng)沙 410013）

黃芪為益腎通絡(luò)方復(fù)方［1］中的一味君藥，在該方中起補(bǔ)氣升陽的作用，為治療氣虛浮腫之要藥。為了明確黃芪在該復(fù)方中的作用機(jī)理我們采用單次尾筋脈注射鹽酸多柔比星注射液7mg／1kg造模方法［2-4］，建立阿霉素腎病（adriamycin-induced nephropathy，ADRN）模型，觀察黃芪對(duì)腎組織中Smad4的影響，探討黃芪對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 8周齡，體重180～200g之間的SPF級(jí)Sprague Daw ley（SD）大鼠，購自長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）

2009-0012。

1.2 藥物和試劑 注射用鹽酸多柔比星（浙江海正藥業(yè)股份有限公司111201）總蛋白測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司20121102）；β-actin多克隆抗體（博士德生物公司），兔抗Smad4 多克隆抗體（CST），全自動(dòng)生化分析儀（Olympus AU400）。

1.3 模型建立及試驗(yàn)分組，給藥 將21只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白組、ADRN造模組、黃芪治療組。造模組將注射用鹽酸多柔比星用生理鹽水溶解為2mg/mL，大鼠一次尾靜脈注射鹽酸多柔比星7mg/kg，空白組和黃芪治療組僅注射等量生理鹽水。然后標(biāo)準(zhǔn)條件下再飼養(yǎng)三周，總共需要四周，然后收集24h尿液并測(cè)定24h尿蛋白（hupro）。造模大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿時(shí)視為造模成功。隨后黃芪組每天灌服1mL/100g黃芪湯劑（由單味藥黃芪經(jīng)煎煮濃縮至0.28g/mL），空白組和ADRN組每天灌服1 mL/100g蒸餾水，每天灌服一次，連續(xù)三周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)模前、灌藥前、灌藥后24h尿蛋白，灌藥后第八周大鼠眼眶后靜脈叢取血后摘取腎臟分別進(jìn)行血液標(biāo)本和腎組織的各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，免疫印跡（western blot）檢測(cè)腎組織Smad4。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較用單因素方差分析；western結(jié)果用Image Pro軟件分析灰度后進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，用Bartlett檢驗(yàn)方差齊性，然后進(jìn)行方差分析和Tukey多重比較。

2 結(jié)果

2.1 各組生化指標(biāo) 由表1可見，模前24huPro測(cè)定結(jié)果顯示，其含量均小于5mg/24 h，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,提示6組模前24huPro測(cè)定結(jié)果具有可比性；灌前24huPro測(cè)定結(jié)果顯示，除空白組含量小于5mg/24h外，其他組含量均大于200mg/24h，提示造模成功；灌胃后，24huPro、血Scr及BUN模型組與空白組相比均明顯增高（其中24huPro 和BUN P<0.01，Scr P<0.05），治療組與模型組相比下降明顯（P<0.01）；而ALB模型組低于空白組織（P<0.01），治療組高于模型（P<0.01）。

表1 各組生化指標(biāo)比較

2.2 病理學(xué)檢查 大鼠腎小球在光學(xué)顯微鏡水平下的觀察（圖1）：（1）空白組：腎小球出現(xiàn)正常（HE染色;放大倍數(shù)10×40）。 （2）造模組1：腎小球，鮑曼囊增厚（HE染色；放大倍數(shù)10×40）。（3）造模組2：在泌尿空間出現(xiàn)玻璃樣的腎小球和嚴(yán)重的毛細(xì)血管擴(kuò)張（HE染色;放大倍數(shù)10×40）。（4）黃芪組：腎小球損傷較空白組有一定損傷，較模型組則有修復(fù)（HE染色；放大倍數(shù)10×40）。

圖1 大鼠腎臟病理檢查結(jié)果（HE染色）

2.3 對(duì)腎組織Sm ad4表達(dá)的影響 結(jié)果顯示Smad4在造模組腎組織中的表達(dá)明顯高于空白組和黃芪組，而黃芪組較造模組表達(dá)有明顯下降（P<0.01）。見表2，圖2。

表2 3組大鼠Smad4蛋白表達(dá)情況

圖2 腎組織中Smad4蛋白表達(dá)

3 討論

益腎通絡(luò)方為一個(gè)中藥復(fù)方, 主要針對(duì)腎病綜合癥腎虛夾瘀的病機(jī)特點(diǎn)，以補(bǔ)腎化閼為主要治法進(jìn)行處方用藥，其中黃芪作為益腎通絡(luò)方的一味君藥，有補(bǔ)氣固表、利尿托毒的功效，可用于治療氣虛水腫、慢性腎炎蛋白尿［5］等，已被大量應(yīng)用于臨床輔助治療腎病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芪湯劑可顯著升高阿霉素造模大鼠ALB，降低24尿蛋白定量、BUN、Scr，改善腎功能。在前期的研究［6-7］中我們已經(jīng)找到有效控制黃芪在該復(fù)方中質(zhì)量的方法，并將其視為一種主要的復(fù)方質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)。

腎纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同病理過程，研究表明［8］轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是最主要的致纖維化因子。Smads作為TGF-β1的下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為3個(gè)亞家族，其中Smad4是共同通路型Smad（Co-Smad），TGF-β/Smads信號(hào)通路中的信號(hào)由細(xì)胞核外進(jìn)入核內(nèi)要借助于Smad4的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能，Smad4通過與磷酸化的R-Smads結(jié)合成復(fù)合物，在Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著信號(hào)的正向傳導(dǎo)放大作用，Smads蛋白的生物效應(yīng)都是在Smad4的參與下與其他Smad蛋白互相配合而完成。在本實(shí)驗(yàn)中，黃芪灌胃后Smad4在腎組織中陽性表達(dá)明顯降低，提示黃芪可能通過影響Smad4的表達(dá)直接參與TGF-β1抑制腎組織纖維化進(jìn)展。

黃芪有利尿消腫、防止或逆轉(zhuǎn)尿蛋白的作用，現(xiàn)代研究也證明黃芪能抑制致纖維化細(xì)胞因子［9］，這應(yīng)該是本實(shí)驗(yàn)所研究通過影響Smad4的表達(dá)進(jìn)而抑制腎組織纖維化、硬化過程的結(jié)果，然而現(xiàn)代研究證明黃芪含有黃芪皂苷、黃芪多糖、黃芪黃酮類化合物等成份［10］，究竟是某種成分單獨(dú)作用的結(jié)果還是多種成分共同作用的結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。

［1］楊智, 向愛國(guó), 金紅, 等. 中藥復(fù)方對(duì)腎病綜合片大鼠腎功能影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 湖南中醫(yī)雜志. 2007, 23(2): 82-83.

［2］Boonsanit D, Kanchanapangk S, Brranakarlc C. L-carnitine ameliorates doxorubicin-induced nephroticsyndrome in rats［J］. Nephrolgy(carlto),2006, 11(4)313-320.

［3］藺建軍, 楊勇, 高娜, 等. 阿霉素注射次數(shù)及劑量對(duì)腎病綜合征模型的影響［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志. 2011, 12(8A): 676-678.

［4］張勇, 張蓓, 寧華英, 等. 單次尾靜脈注射法阿霉素大鼠腎病模型的建立［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2013, 21(1A): 1-4.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典（2010版, 第1部）. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010.

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［9］陳晶, 張博華. 黃芪、大黃的抗腎纖維化作用研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2011, 39(6): 101-104.

［10］溫燕梅. 黃芪的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］. 中成藥, 2006, 28(6): 881-883.