索拉菲尼與BrMC合用對SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的影響

肖 蕎，孫姝雯，崔迎紅，曹曉正，曹建國

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，長沙 410013）

索拉菲尼（sorafenib，SO）是現(xiàn)今一線治療肝細(xì)胞癌的一種多激酶抑制劑。有研究證實SO通過阻斷RAF/MEK/ERK通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細(xì)胞凋亡［1］。然而，腫瘤干細(xì)胞由于組成性活化核因子κB（nuclear factors κB，NF-κB）耐受 SO 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。研究證明8-溴-7-甲氧基白楊素（8-bromo-7-methoxychrysin，BrMC）通過促進(jìn)ROS生成和ROS依賴持續(xù)性JNK活化誘導(dǎo)人HCC細(xì)胞凋亡［3］。我們新近研究證實BrMC具有靶向抑制肝癌干細(xì)胞特性和功能作用［4，5］。本文研究BrMC是否具有增強(qiáng)SO誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡作用，并探討其作用機(jī)制是否涉及下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系（SMMC-7721）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所（中國上海市）。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2混合氣體，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)和擴(kuò)增。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2 SMMC-7721細(xì)胞系干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)及腫瘤球形成細(xì)胞傳代培養(yǎng)

1.2.1 SMMC-7721細(xì)胞系干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng) 取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5min去血清，棄上清，加入PBS洗滌1~2次，離心后以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（添加100IU/mL青霉素G、100μg/mL鏈霉素、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、2% B27、0.4% BSA和4μg/mL 胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基）懸浮培養(yǎng)于超低粘附6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5000個。每隔2天加入新鮮干細(xì)胞條件培養(yǎng)基1mL直至第4天，球體達(dá)到50μm直徑大小。

1.2.2 腫瘤球形成細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 收集上述球體達(dá)到50μm直徑大小的腫瘤球形成細(xì)胞，600r/min離心5min，小心吸棄上清，加入0.05% EDTA-胰蛋白酶消化3min，加入干細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化后，機(jī)械分散細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液，800r/min離心5min去除胰蛋白酶，計數(shù)，重新在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測 為了研究SO、BrMC及兩者合用對SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的影響。以每毫升 5×105個細(xì)胞數(shù)接種至超低粘附6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔2mL。不同濃度SO（2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L 和 50μmol/L）和 BrMC（10μmol/L）分別單獨(dú)處理作為對照，兩者合用包括2.5μmol/L SO+10μmol/L BrMC、5μm ol/L SO+10μm ol/LBrMC、10μmol/L SO+10μmol/L BrMC、50μmol/L SO+10μmol/L BrMC添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24h，收集各組干細(xì)胞樣細(xì)胞用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（A211-01型，唯贊生物）處理后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀（C6型BD流式細(xì)胞儀，美國）分析。激發(fā)波長為488 nm；FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI的紅色熒光在FL2通道檢測。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析；繪制散點(diǎn)圖，F(xiàn)L1為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L2為縱坐標(biāo)。每個樣本至少采集10000個細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.4 W estern b lot分析 處理的細(xì)胞以PBS沖洗一遍，加入1mL裂解酶緩沖液（50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40、10% 丙三醇、1M β-Me、1μg/mL抑肽酶、0.5μg/mL抑酶醛肽、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF及蛋白酶抑制劑）孵育30min，刮取并收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解液經(jīng)13 200×g，4℃ 條件下離心5m in，制備全細(xì)胞總蛋白提取物。Bradford試驗（Bio-Rad Laboratories，Hercule s，CA）測定蛋白質(zhì)含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在PBST中以脫脂牛奶5%（w/v）對PVDF膜進(jìn)行封閉隨后以鼠抗人NF-κB（p65）單克隆抗體作為一抗孵育，輕微震動下，4℃條件下過夜。沖洗膜四次，以過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育上述PVDF膜1h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（Amersham Biosciences）對信號進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 人肝細(xì)胞癌SMM C-7721細(xì)胞系成球培養(yǎng)與我們先前發(fā)表文獻(xiàn)［4，5］的結(jié)果一致，人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系干細(xì)胞條件培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)能得到腫瘤球形成細(xì)胞，并可連續(xù)傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增（圖1）。

圖1. 人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系腫瘤球倒置相差顯微圖像（×40）

2.2 BrMC增強(qiáng)SO誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞凋亡作用 Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果證明，BrMC（10.0μmol/L）和SO（2.5、5.0、10.0和50.0μmol/L）分別單獨(dú)處理SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞24h輕度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖2）；SO（2.5、5.0、10.0和 50.0μmol/L）分別聯(lián)合 BrMC（10.0μmol/L）處理協(xié)同性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖2）（P<0.05）。

2.3 人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞高表達(dá) NF-Κb（p65）蛋白 Western blot分析結(jié)果顯示 ：與親本細(xì)胞相比，人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞NF-Κb（p65）蛋白高表達(dá)（圖3）。

圖2 BrMC、SO以及兩者合用對SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞凋亡的影響。與溶媒（0.1% DMSO）對照組比較，*P<0.01；與相同濃度SO單獨(dú)處理組比較，＃P<0.05。SO：索拉菲尼，BrMC：8-溴-7-甲氧基白楊素。

圖3 人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞與親本細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白表達(dá)的比較

2.4 BrMC、SO以及兩者合用對SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞NF-Κb（p65）蛋白表達(dá)的影響 Western Blot分析結(jié)果表明：：SO和BrMC聯(lián)合應(yīng)用相比于SO或BrMC單用的對照組有更明顯地抑制凋亡抗性蛋白NF-κB（p65）表達(dá)的作用（圖4）。

圖4 SO、BrMC及兩者合用對SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞蛋白NF-κB（p65）表達(dá)的影響

3 討論

干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法是基于腫瘤干細(xì)胞具有失巢性凋亡抗性的性質(zhì)富集和分選腫瘤干細(xì)胞的一種有效方法。其原理如下：干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法是在無血清的條件下，添加成分完全明確的生長因子代替血清，使其既滿足細(xì)胞生長需要，同時又避免血清的誘導(dǎo)分化問題［6］。在本研究中，我們以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法富集SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，證實腫瘤細(xì)胞呈非粘附性克隆球生長（圖1）。提示：本研究中以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法富集球形成細(xì)胞具有干細(xì)胞樣細(xì)胞特性。

BrMC是白楊素的一種衍生物。已有研究表明BrMC誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和靶向抑制肝癌干細(xì)胞特性和功能［4，5］。SO也能通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)途徑，降低elF4E的磷酸化水平，下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡［2］。本研究使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)：SO與BrMC聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞凋亡率高于各藥單獨(dú)用藥組誘導(dǎo)凋亡率之和，這些結(jié)果提示BrMC能有效增強(qiáng)SO誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡作用（圖2）。

在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌的小鼠模型最近的研究表明，SO和相關(guān)的抗血管生成物質(zhì)在初始抗腫瘤作用后，顯示出增強(qiáng)腫瘤進(jìn)展和增加轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用［7，8］。潛在機(jī)制可能是由于抗血管生成治療導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)，并選擇高度耐藥腫瘤干細(xì)胞適應(yīng)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)耗竭。在各種惡性腫瘤，包括胰腺癌和高度治療耐受的胰腺腫瘤細(xì)胞中可以觀察到NF-κB過表達(dá)［9，10］。我們的研究結(jié)果首次表明：與親本細(xì)胞相比，SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白高表達(dá)（圖3）。值得注意的是，我們的結(jié)果證實：BrMC與SO合用協(xié)同性下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白表達(dá)（圖4）；提示：BrMC增強(qiáng)增強(qiáng)SO誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡作用可能涉及其協(xié)同下調(diào)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)和抑制NF-κB活性。

總之，本文的實驗研究證實BrMC和SO具有誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721球形成細(xì)胞凋亡作用，兩者合用就協(xié)同效應(yīng)。BrMC與SO聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同性下調(diào)下調(diào)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)。為臨床聯(lián)合應(yīng)用BrMC和SO治療肝細(xì)胞癌提供了實驗依據(jù)。

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