膽管癌患者外周血免疫抑制細(xì)胞的檢測及其臨床意義＊

徐曉東， 王 敏， 田 銳， 李 旭， 郭興軍， 彭 豐， 胡 均， 秦仁義△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，武漢 430030

2天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究所，腫瘤醫(yī)院結(jié)腸癌外科，國家臨床腫瘤研究中心，癌癥預(yù)防和治療重點實驗室，天津 300060

膽管癌患者外周血免疫抑制細(xì)胞的檢測及其臨床意義＊

徐曉東1， 王 敏1， 田 銳1， 李 旭1， 郭興軍1， 彭 豐1， 胡 均2△， 秦仁義1△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，武漢 430030

2天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究所，腫瘤醫(yī)院結(jié)腸癌外科，國家臨床腫瘤研究中心，癌癥預(yù)防和治療重點實驗室，天津 300060

目的 研究膽管癌患者外周血中CD14＋CD11b＋HLA－DR－髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的表達(dá)及其與臨床分期和術(shù)后病理檢測的關(guān)系，并對其形成機(jī)制和功能進(jìn)行初步研究。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了25例膽管癌、10例胰腺癌、9例膽囊癌患者和25例同齡的健康對照者外周血中CD14＋CD11b＋HLA－DR－髓源性抑制細(xì)胞的比例并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 健康成人對照組外周血中CD14＋CD11b＋HLA－DR－MDSC的比例為（0.65±0.25）%，膽管癌組患者比例顯著增高為（2.14±1.38）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，在胰腺癌組和膽囊癌組患者中MDSC的表達(dá)水平亦升高。MDSC的表達(dá)水平與膽管癌的臨床分期相關(guān)，其中Ⅳ期膽管癌患者的MDSC水平最高。膽管癌患者術(shù)后的MDSC水平較術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。但是，MDSC的表達(dá)水平與膽管癌患者術(shù)后的病理分期無關(guān)。兩種膽管癌細(xì)胞系（QBC939、TFK－1）體外均能誘導(dǎo)PBMC向MDSC的轉(zhuǎn)化，且隨著腫瘤負(fù)荷的增加而增加。和健康對照組比，膽管癌患者外周血中發(fā)揮抑制功能的精氨酸酶活性增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 膽管癌患者外周血中CD14＋CD11b＋HLA－DR－MDSC的比例顯著升高，且與腫瘤的臨床分期呈正相關(guān)，可作為膽管癌患者早期診斷的重要標(biāo)記物。

膽管癌； 髓源性免疫抑制細(xì)胞； 精氨酸酶

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells，MDSC）是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細(xì)胞亞群，它可以通過多種途徑抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且在炎癥、自身免疫、移植免疫和腫瘤中發(fā)揮重要作用。研究表明，腫瘤患者外周血中免疫抑制細(xì)胞的比例增加，能夠促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸［1］。但國內(nèi)外至今尚缺乏對CD14＋CD11b＋HLA－DR－MDSC在膽管癌患者中研究的報道。為了研究該群細(xì)胞在膽管癌患者免疫逃逸中的作用，我們通過流式細(xì)胞術(shù)對25例膽管癌患者術(shù)前及14例接受根治性切除手術(shù)的患者術(shù)后的外周血MDSC的比例進(jìn)行檢測，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病例組25例膽管癌患者均來自武漢市同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科2011年11月至2012年11月住院的患者，其中男16例，女9例，年齡41～72歲，中位數(shù)56歲（表1）。所有經(jīng)根治性手術(shù)治療的病例均經(jīng)過病理確診，全部患者尚未進(jìn)行抗腫瘤治療且近3個月未使用免疫抑制劑。根據(jù)AJCC對膽管癌進(jìn)行分期，可切除膽管癌符合AJCC臨床分期的Ⅰ和Ⅱ期，不可切除膽管癌符合AJCC臨床分期的Ⅲ和Ⅳ期。17例可切除的膽管癌患者中，12例患者最終接受了根治性的腫瘤切除術(shù)，1例患者放棄了在同濟(jì)醫(yī)院的治療，4例患者接受了姑息性手術(shù)。8例不可切除的膽管癌患者中，2例患者最終接受了根治性的腫瘤切除術(shù)。10例胰腺癌，9例膽囊癌和25例同齡的健康對照者均來源于本科室同期住院患者，其中健康對照者為本科室住院的非腫瘤患者。

表1 患者一般情況Table 1 Clinical characteristics of patients

1.2 試劑和設(shè)備

MDSC的檢測使用的是BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀（型號為LSRⅡ）。FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD14單克隆抗體，PE－CY－7標(biāo)記的小鼠抗人CD11b單克隆抗體，APC標(biāo)記的小鼠抗人HLADR單克隆抗體及其匹配的同型對照均購自BD公司。紅細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，F(xiàn)CS（流式緩沖液）購自BD公司。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測

患者入院后于次日清晨空腹抽取靜脈血4 m L，肝素抗凝，取100μL抗凝全血，用紅細(xì)胞裂解液充分裂解后，按照試劑盒說明書量取不同熒光標(biāo)記抗體直接標(biāo)記檢測外周血白細(xì)胞膜表面CD14、CD11b和HLA－DR抗原的表達(dá)情況，同時標(biāo)記同型對照，4℃避光孵育30 min，流式緩沖液洗滌2次后上機(jī)檢測。首先圈取CD14＋CD11b＋的細(xì)胞群，該群細(xì)胞主要表達(dá)于外周血單個核細(xì)胞中，然后選擇HLA－DR－的細(xì)胞群即為MDSC。

1.4 MDSC的體外誘導(dǎo)

在6孔板中，取健康人1×105個外周血單個核細(xì)胞重懸后分別與2種膽管癌細(xì)胞系（QBC939和TFK－1）在1640無血清培養(yǎng)液（博士德，武漢）中37℃共培養(yǎng)48 h，對照組細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，誘導(dǎo)后的外周血單個核細(xì)胞通過輕輕刮取后獲得。熒光抗體標(biāo)記混合的外周血單個核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞后上機(jī)檢測。

1.5 血清中精氨酸酶活性的檢測

25例膽管癌患者和25例健康對照組血清中精氨酸酶活性的檢測使用的是商業(yè)化的人精氨酸酶活性酶聯(lián)免疫分析試劑盒（博士德，武漢）。發(fā)生溶血的標(biāo)本被剔出，每個樣本設(shè)3個平行實驗組。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算平均吸光度值，精氨酸酶活性的計算方式為單位每毫升（U／m L）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌患者外周血中MDSC水平的檢測

在不同分期的膽管癌患者新采的外周全血中檢測CD14＋CD11b＋HLA－DR－MDSC的比例，結(jié)果用MDSC占外周血單個核細(xì)胞的比例計算。1例正常人（圖1 A）、1例Ⅱ期膽管癌患者（圖1B）和1例Ⅳ期膽管癌患者（圖1C）代表性的流式分析結(jié)果圖如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中髓源性抑制細(xì)胞的比例Fig.1 Proportion of MDSC in peripheral blood detected by FACS

2.2 MDSC與膽管癌患者臨床分期的關(guān)系

我們檢測了25例膽管癌患者外周血中MDSC的比例（2.14±1.38）%顯著高于年齡匹配的正常志愿者（0.65±0.25）%（P＜0.05，圖2A）。同樣，在10例胰腺癌患者及9例膽囊癌患者中也可見到CD14＋CD11b＋HLA－DR－MDSC的大量擴(kuò)增，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然后，我們分析了該25例患者外周血MDSC的比例和臨床分期的關(guān)系。如圖2B所示，處于不同臨床分期的膽管癌患者與對照組相比，外周血MDSC的比例均明顯升高，且隨著腫瘤臨床分期的增加MDSC的比例也明顯升高，其中Ⅳ期膽管癌患者M(jìn)DSC的比例最高。

圖2 髓源性抑制細(xì)胞在不同腫瘤中的表達(dá)水平及其與膽管癌臨床分期的關(guān)系Fig.2 Expression levels of MDSC in different tumors and relationship between the expression and clinical stages of cholangiocarcinoma

2.3 根治性手術(shù)治療對患者M(jìn)DSC水平的影響

對接受根治性手術(shù)治療的14例膽管癌患者檢測術(shù)后第7天外周血MDSC的水平。術(shù)前外周血MDSC的平均水平為（4.24±1.18）%，而手術(shù)后MDSC的平均水平下降為（2.34±1.65）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。對14例接受手術(shù)治療的膽管癌患者，按照術(shù)后病理結(jié)果分組，其中低分化組和中－高分化組的MDSC水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.35）。

2.4 體外MDSC的誘導(dǎo)

膽管癌患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中MDSC的比例比正常人增多。為了證明腫瘤負(fù)荷和腫瘤來源的細(xì)胞因子與MDSC的擴(kuò)增有關(guān)，我們以2種膽管癌細(xì)胞系與2個健康志愿者外周血中單個核細(xì)胞共培養(yǎng)來誘導(dǎo)MDSC。2種膽管癌細(xì)胞系都能誘導(dǎo)MDSC且隨著腫瘤細(xì)胞比例的增加而增加（P＜0.05，圖3A）。接著，我們比較了2種膽管癌細(xì)胞系誘導(dǎo)能力的差異，2種膽管癌細(xì)胞系與同一個健康志愿者的外周血單個核細(xì)胞以10∶1的比例共培養(yǎng)。QBC939細(xì)胞有著較強(qiáng)的誘導(dǎo)MDSC的能力（P＜0.05，圖3B）。

圖3 膽管癌細(xì)胞系體外誘導(dǎo)正常人外周血單個核細(xì)胞向髓源性抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Fig.3 Cholangiocarcinoma cell lines induced transformation of normal PBMC into MDSC in vitro

2.5 外周血中精氨酸酶活性的檢測

精氨酸代謝是髓源性抑制細(xì)胞介導(dǎo)免疫抑制的一個主要機(jī)制。這里，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，膽管癌患者血清中精氨酸酶活性為（92±45）U／m L，健康對照組血清中精氨酸酶的活性為（48±32）U／m L，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

MDSC限制腫瘤免疫治療的效果，且參與了腫瘤的免疫逃逸，因此亟須對該群細(xì)胞的特征及功能進(jìn)行研究［1］。已有文獻(xiàn)報道，CD14＋的MDSC在多種實體腫瘤中表達(dá)增高［24］，而膽管癌外周血中此群細(xì)胞的研究較少。因此，我們研究分析了不同分期的膽管癌患者外周血中CD14＋的MDSC的比例、來源及免疫抑制功能。

同以往對實體瘤中MDSC亞群的研究結(jié)果一致，我們的結(jié)果表明單核群MDSC的比例比正常人顯著升高。同樣，我們發(fā)現(xiàn)在早期膽管癌和中晚期膽管癌患者之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但是，在結(jié)腸癌患者中，早期患者CD33＋的MDSC只是輕度的增加［5］。同時，CD14＋群的細(xì)胞在胰腺癌和膽囊癌中也能檢測到表達(dá)增加，說明這群細(xì)胞在多種腫瘤中表達(dá)增加，可能可以作為多種實體腫瘤早期監(jiān)測的指標(biāo)。

腫瘤能夠誘導(dǎo)MDSC引起免疫抑制而促進(jìn)自身的免疫逃逸，那么膽管癌患者在接受根治性手術(shù)后，在去除腫瘤負(fù)荷的條件下我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后外周血中MDSC的比例顯著下降。接受手術(shù)治療的腫瘤患者，其術(shù)后病理分期是影響預(yù)后的重要因素。但是我們發(fā)現(xiàn)，不同病理分期的膽管癌患者術(shù)后外周血中的MDSC沒有顯著差異，因此術(shù)后患者外周血MDSC的水平不能用于手術(shù)患者預(yù)后的監(jiān)測。

文獻(xiàn)報道MDSC在多種腫瘤的動物模型和腫瘤患者中表達(dá)增加，并且它們的擴(kuò)增似乎與腫瘤負(fù)荷和臨床分期相關(guān)［36］。我們推測正常的外周血單個核細(xì)胞接觸膽管癌細(xì)胞后能呈現(xiàn)出類MDSC的特性且數(shù)量增加。為了深入研究這種現(xiàn)象，將2種膽管癌細(xì)胞系與健康志愿者外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)MDSC，以模擬膽管癌患者體內(nèi)MDSC的形成機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)2種膽管癌細(xì)胞系均能成功誘導(dǎo)CD14＋的MDSC，并且CD14＋的MDSC數(shù)量隨著腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加而增加。因此，可能意味著CD14＋的MDSC是膽管癌中較常見的一群，且可能作為膽管癌早期診斷的一個有用的指標(biāo)。

表達(dá)高水平的精氨酸酶是髓源性抑制細(xì)胞免疫抑制的第一關(guān)鍵機(jī)制，微環(huán)境中精氨酸的缺乏能顯著抑制T細(xì)胞的功能［7］。血清和腫瘤微環(huán)境中升高的精氨酸酶活性已經(jīng)在多種腫瘤中有過報道，包括腎癌、皮膚癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［810］。我們也在膽管癌患者血清中檢測到精氨酸酶的活性顯著高于對照組，了解這一機(jī)制能為阻斷免疫抑制治療的研究提供基礎(chǔ)。

總之，我們發(fā)現(xiàn)了膽管癌患者外周血中一群與腫瘤臨床分期相關(guān)的CD14＋CD11b＋HLA－DR－的MDSC。在膽管癌患者化療時，也要考慮聯(lián)合靶向髓源性抑制細(xì)胞群的策略［1013］。

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（2014－10－15 收稿）

Detection and Clinical Analysis of Myeloid Derived Suppressor Cells of Peripheral Blood in Patients with Cholangiocarcinoma

Xu Xiaodong，Wang Min，Tian Rui et al
Department of Biliary－Pancreatic Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To study expression level of CD14＋CD11b＋HLA－DR－myeloid derived suppressor cells in peripheral blood of patients with cholangiocarcinoma，and relationship between the expression and clinical stage，pathological grade，and to preliminarily investigate the mechanisms.Methods From 25 cholangiocarcinoma patients，10 pancreatic cancer patients，9 gallbladder carcinoma patients and 26 age－matched healthy controls，CD14＋CD11b＋HLA－DR－myeloid derived suppressor cells were collected from peripheral blood and analyzed by flow cytometry.Results Proportion of yeloid derived suppressor cells of normal healthy group was（0.65±0.25）%，and（2.14±1.38）%for bile duct cancer group，with significant difference（P＜0.05）.Meanwhile，elevated levels of MDSC were also detected in pancreatic cancer and gallbladder cancer.Expression level of MDSC was correlated with clinical stages of cholangiocarcinoma，and it was highest in IV stage patients.After radical operation，MDSC level decreased significantly in cholangiocarcinoma patients（P＜0.05）.However，MDSC level was not related with pathological stage of cholangiocarcinoma patients after surgery.Two cholangiocarcinoma cell lines could successfully induce PBMC to transform into MDSC in vitro，and the transformation was increased with tumor burden.Critical suppressive enzyme arginase was significantly more active in cholangiocarcinoma patients than in control group（P＜0.05）.Conclusion Proportion of myeloid derived suppressor cell level in cholangiocarcinoma patients are significantly elevated and positively related with clinical stages，and it can be used as an early marker for detection of cholangiocarcinoma.

cholangiocarcinoma； myeloid derived suppressor cells； arginase

R735.8

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.011

＊國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81101870，No.81402443）

徐曉東，男，1987年生，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:tjxuxiaodong＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，胡 均E－mail:hnxymaomaojun＠163.com；秦仁義E－mail:ryqin＠tjh.tjmu.edu.cn