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    苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝的優(yōu)化

    2015-06-15 00:43:20林巧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:提取

    林巧

    摘要:基于ELISA檢測方法,對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝進行優(yōu)化,尋求苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1最佳提取條件。通過空白加標(biāo)回收試驗、樣品加標(biāo)回收試驗,證明ELISA檢測方法的可行性,對料液比、超聲時間、超聲振幅3個變量進行正交試驗。結(jié)果表明,用ELISA檢測黃曲霉毒素B1的方法是切實可行的,在提取液溶劑配比甲醇 ∶ 水為6 ∶ 4、料液比為1 ∶ 5、最佳超聲時間15 min、最佳超聲振幅15Φ的條件下能得到最佳提取效果。

    關(guān)鍵詞:苦蕎麥;提取;黃曲霉毒素B1;ELISA

    中圖分類號: R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2015)04-0302-03

    收稿日期:2014-04-30

    基金項目:四川省教育廳科研重點項目(編號:13ZA0157)。

    作者簡介:林 巧(1978—),女,碩士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)與微生物研究。E-mail:13778672269@163.com。

    苦蕎麥會在貯藏加工過程中污染黃曲霉毒素,黃曲霉毒素毒性極強,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥的毒性,其中以黃曲霉毒素B1毒性最大。ELISA試驗是一種特異性強,敏感性高,重復(fù)性好的試驗方法。本試驗采用ELISA檢測苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1,為了加強黃曲霉毒素的溶解度及擴散,有利于毒素的提取完全,利用超聲波輔助提取。本試驗研究了不同條件對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取效果的影響,通過ELISA試劑盒對黃曲霉毒素B1含量進行測定,對提取方法中溶劑配比、料液比、超聲時間、超聲頻率進行優(yōu)化,從而得到黃曲霉毒素B1的最佳提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    苦蕎麥麩:從西昌航飛科技發(fā)展有限公司采集苦蕎麥麩皮粉。

    1.2 儀器設(shè)備

    酶標(biāo)儀,美國熱電公司生產(chǎn);MS2型微量振蕩器,德國IKA公司生產(chǎn);微量移液器,芬蘭雷勃公司生產(chǎn);超聲波細(xì)胞粉碎機,浙江寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱,上海悅豐儀器儀表有限公司生產(chǎn)。

    1.3 試劑

    ELISA試劑盒,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;甲醇、無水乙醇、三氯甲烷、分析純。

    1.4 試驗方法

    1.4.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗 將溶劑甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。在空白提取溶劑中加入不同量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品,使其每組最終濃度分別達(dá)到0.1、1.0、2.0 μg/L[1]。用ELISA法檢測,同時做5組平行。按如下公式計算:

    回收率=檢測出AFB1的含量添加入的AFB1的含量×100%。 1.4.2 樣品加標(biāo)回收試驗 將甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入 10 mL提取溶液,超聲振幅為3Φ,超聲萃取10 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液。測定原樣品中黃曲霉毒素B1的含量,按1 ∶ 1比例加入濃度分別為0.1、1.5、5.0 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品50 μL[2]。用ELISA檢測。按如下公式計算:

    回收率=總的AFB1含量-原樣品中AFB1含量添加入AFB1的量×100%。

    1.4.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響 用6 ∶ 4的甲醇作溶劑,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,按照料液比1 g ∶ 4 mL、1 g ∶ 5 mL、1 g ∶ 6 mL、1 g ∶ 7 mL、1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 9 mL加入溶劑,超聲振幅為3Φ,超聲波萃取10 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液[3],用ELISA檢測。

    1.4.4 不同超聲時間對黃曲霉毒素B1提取的影響 選用提取溶劑比6 ∶ 4和料液比1 g ∶ 5 mL進行試驗,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液,超聲波萃取,振幅為3 Φ,時間分別采用5、10、15、25、35、50 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液[4],用ELISA檢測。

    1.4.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響 采用最佳提取溶劑6 ∶ 4、料液比1 g ∶ 5 mL、超聲時間15 min進行試驗,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液,超聲波萃取,振幅分別為3、6、10、15、20 Φ,離心取上清液,即為待測樣品提取液。用ELISA檢測。

    1.4.6 正交試驗 根據(jù)正交試驗原理,選取料液比(A)、超聲時間(B)、超聲振幅(C)對黃曲霉毒素B1提取影響顯著的3個因素,每個因素3個水平,選用L9(33)正交表,并對數(shù)據(jù)進行極差分析,最后在一定水平范圍內(nèi)取最佳值[5]。正交試驗因素與水平設(shè)計見表 1。

    1.5 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1含量的測定

    1.5.1 樣品處理 取經(jīng)過上述超聲處理后的提取溶劑 5 mL,加入10 mL三氯甲烷,振蕩5 min,離心分層, 取出下層

    表1 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝正交試驗因素水平

    水平

    因素

    A:料液比

    (g ∶ mL) B:超聲時間

    (min) C:超聲振幅

    (Φ)

    1 1 ∶ 4 10 10

    2 1 ∶ 5 15 15

    3 1 ∶ 6 20 20

    三氯甲烷相;向上層水相中再加入10 mL三氯甲烷,按上述方法重復(fù)提取1次,合并三氯甲烷相;于50 ℃下水浴蒸干;加入2 mL樣品提取液,溶解揮干物;再加入8 mL樣品稀釋液進行稀釋;取稀釋后液體待測。endprint

    1.5.2 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對應(yīng)的微孔中,加AFB1酶標(biāo)物50 μL/孔,再加入AFB1抗試劑50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置 37 ℃ 避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

    1.5.3 洗板 小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液300 μL/孔,充分洗滌5次,每次間隔30 s,用吸水紙拍干。

    1.5.4 顯色 加入底物液A液50 μL/孔,再加底物液B液50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37 ℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min。

    1.5.5 測定 加入終止液50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于雙波長D450 nm/D630 nm檢測,在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù),測定每孔D值。

    1.5.6 ELISA試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線 用ELISA標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、100、250、500、1 500、5 000 ng/L進行3次重復(fù)試驗,取平均值。利用RIDAWIN軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖 1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗

    ELISA檢測過程中會受到試劑、溫度、儀器靈敏度等因素的影響。為了研究提取溶劑本身對ELISA的影響,比較不同溶劑的回收率。按照“1.4.1”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取平均值。計算加標(biāo)回收率,試驗結(jié)果見表2。

    表2 空白溶劑加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    提取溶劑

    (甲醇 ∶ 水)

    添加100 ng/kg

    AFB1 1 000 ng/kg

    AFB1 2 000 ng/kg

    AFB1

    檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%) 檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%) 檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%)

    9 ∶ 1 81.4 81.4 1 178.1 117.8 1 933.7 96.7

    8 ∶ 2 82.5 82.5 1 196.3 119.6 1 893.3 94.7

    7 ∶ 3 88.7 88.7 967.1 96.7 1 804.3 90.2

    6 ∶ 4 109.2 109.2 877.1 87.7 1 780.2 89.0

    5 ∶ 5 114.2 114.2 924.5 92.5 2 372.2 118.6

    由表2可知,直接用不同溶劑配比進行加標(biāo)試驗,不同提取方法的回收率在81.4%~119.6%之間。根據(jù)回收率在70%~120%之間可行,結(jié)果表明,采用上述提取溶劑,并用ELISA檢測是可行的。

    2.2 樣品加標(biāo)回收試驗

    苦蕎麥麩中可能含有某些干擾物質(zhì),對提取效果會有一定干擾。為了研究樣品中干擾物質(zhì)對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取的影響,按照“1.4.2”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取平均值,計算加標(biāo)回收率,試驗結(jié)果見表3。

    表3 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    提取溶劑

    (甲醇 ∶ 水) 稀釋10倍后樣品中

    AFB1的含量(ng/L)

    添加100 ng/L 添加1 500 ng/L 添加5 000 ng/L

    檢測值(ng/L) 回收率(%) 檢測值(ng/L) 回收率(%) 檢測值(ng/L) 回收率(%)

    9 ∶ 1 101.1 121.1 141.1 703.5 87.06 1 867.2 72.67

    8 ∶ 2 139.2 134.2 129.2 687.4 82.37 2 315.8 89.85

    7 ∶ 3 117.1 119.9 122.7 637.6 77.21 2 555.4 99.87

    6 ∶ 4 102.1 108.1 114.1 735.2 91.22 2 430.9 95.19

    5 ∶ 5 135.4 141.0 146.6 572.2 67.27 1 933.7 74.64

    由表3可知,在甲醇 ∶ 水比例為9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、5 ∶ 5時回收率均達(dá)到120%以上,不符合回收率的可行標(biāo)準(zhǔn)[6],在甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4時,回收率在91.22%~114.1%之間,最接近100%,回收率最好,即是黃曲霉毒素B1提取時,提取效果最好。因此宜采用甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4的提取溶劑。

    2.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響

    不同的料液比對黃曲霉毒素提取有不同影響,選擇甲醇 ∶ 水比例6 ∶ 4為提取溶劑,按照“1.4.3”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值。試驗結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,在料液比為1 g ∶ 5 mL時,測得的黃曲霉毒素B1的含量最高,表明在料液比為1 g ∶ 5 mL時,提取液的提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是,當(dāng)料液比大于1 g ∶ 5 mL時,樣品與溶劑的接觸不夠,不能充分溶解,導(dǎo)致黃曲霉毒素B1提取不完全;當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶ 5 mL時,正好達(dá)到最佳溶解狀態(tài);當(dāng)料液比小于1 g ∶ 5 mL時,黃曲霉毒素B1的溶解量減少,導(dǎo)致檢測的含量減少,曲線呈下降趨勢[7]。

    2.4 不同超聲時間對黃曲霉毒素B1提取的影響

    采用不同的超聲時間對黃曲霉毒素B1進行提取,按照“1.4.4”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值。試驗結(jié)果

    見圖3。

    由圖3可知,在超聲時間為15 min時,提取的黃曲霉毒素B1含量最高,即是超聲時間為15 min時,黃曲霉毒素B1提取效果最好。當(dāng)超聲時間低于15 min或高于15 min時,檢測含量呈緩慢下降的趨勢,即黃曲霉毒素B1提取含量減少。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是在超聲時間低于15 min時,超聲強度不夠,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不完全;當(dāng)超聲時間為15 min時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取達(dá)到較為完全的狀態(tài),含量最高,提取效果最好;當(dāng)提取時間超過15 min時,由于苦蕎麥在溶劑中浸泡時間過久,導(dǎo)致苦蕎麥中黃曲霉毒素B1有少量降解的現(xiàn)象[8]。endprint

    2.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響

    使用不同的超聲振幅進行試驗,按照“1.4.5”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值,試驗結(jié)果見圖4。

    由圖4可知,隨著超聲振幅的增加黃曲霉毒素B1的含量維持在1 064.6~1 053.7 ng/L之間,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量相對穩(wěn)定。超聲振幅在15Φ時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量最高,提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是當(dāng)超聲振幅小于15Φ時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不夠充分,造成少量差異;當(dāng)超聲振幅大于15Φ時,振幅過高造成黃曲霉毒素B1少量降解[9]。

    2.6 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗

    按照“1.4.6”節(jié)方法進行正交試驗,試驗結(jié)果如表4。

    表4 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗結(jié)果

    序號 A:料液比 B:超聲

    時間 C:超聲

    振幅 AFB1含量

    (ng/L)

    1 A1 B1 C1 1 012.5

    2 A1 B2 C2 1 037.2

    3 A1 B3 C3 1 026.9

    4 A2 B1 C2 1 041.2

    5 A2 B2 C3 1 060.8

    6 A2 B3 C1 1 038.1

    7 A3 B1 C3 1 023.1

    8 A3 B2 C1 1 051.3

    9 A3 B3 C2 1 032.8

    k1 1 025.5 1 025.6 1 034.0

    k2 1 046.7 1 049.8 1 037.1

    k3 1 035.7 1 032.6 1 036.9

    R 21.2 24.2 3.1

    由表4 分析可知,3種因素對黃曲霉毒素B1提取效果影響大小依次為B>A>C,即超聲時間>料液比>超聲振幅。根據(jù)正交試驗得到黃曲霉毒素B1含量,可以得出最優(yōu)的提取條件為A2B2C2,即料液比為1 g ∶ 5 mL,超聲時間為 15 min,超聲振幅15Φ。

    按照A2B2C2的最佳組合進行驗證試驗,同時進行3次平行試驗。用ELISA檢測后測得其含量為1 065.1 ng/L。

    3 結(jié)論

    根據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》、GB/T 18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定》中選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡浔冗M行空白加標(biāo)回收試驗,回收率在81.4%~119.6%之間,表明采用ELISA檢測黃曲霉毒素B1是可行性。

    正交試驗結(jié)果表明,超聲波提取苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1的最佳工藝條件為溶劑配比6 ∶ 4,料液比為1 g ∶ 5 mL,超聲時間為15 min,超聲振幅15Φ。在此條件下提取黃曲霉毒素B1的含量為1 065.1 ng/L,高于同等條件下常規(guī)提取含量 1 055.0 ng/L。

    此外,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取方法中因內(nèi)部提取溶劑及外部環(huán)境因素等要求復(fù)雜,影響提取因素多,在實際工作中還應(yīng)做其他條件的優(yōu)化,如溶劑、溫度、濕度、pH值等,因工作量大而時間有限,本試驗僅對苦蕎麥中黃曲霉毒素B1作初步的優(yōu)化設(shè)計。

    參考文獻(xiàn):

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