• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝的優(yōu)化

    2015-06-15 00:43:20林巧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:提取

    林巧

    摘要:基于ELISA檢測方法,對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝進行優(yōu)化,尋求苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1最佳提取條件。通過空白加標(biāo)回收試驗、樣品加標(biāo)回收試驗,證明ELISA檢測方法的可行性,對料液比、超聲時間、超聲振幅3個變量進行正交試驗。結(jié)果表明,用ELISA檢測黃曲霉毒素B1的方法是切實可行的,在提取液溶劑配比甲醇 ∶ 水為6 ∶ 4、料液比為1 ∶ 5、最佳超聲時間15 min、最佳超聲振幅15Φ的條件下能得到最佳提取效果。

    關(guān)鍵詞:苦蕎麥;提取;黃曲霉毒素B1;ELISA

    中圖分類號: R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2015)04-0302-03

    收稿日期:2014-04-30

    基金項目:四川省教育廳科研重點項目(編號:13ZA0157)。

    作者簡介:林 巧(1978—),女,碩士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)與微生物研究。E-mail:13778672269@163.com。

    苦蕎麥會在貯藏加工過程中污染黃曲霉毒素,黃曲霉毒素毒性極強,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥的毒性,其中以黃曲霉毒素B1毒性最大。ELISA試驗是一種特異性強,敏感性高,重復(fù)性好的試驗方法。本試驗采用ELISA檢測苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1,為了加強黃曲霉毒素的溶解度及擴散,有利于毒素的提取完全,利用超聲波輔助提取。本試驗研究了不同條件對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取效果的影響,通過ELISA試劑盒對黃曲霉毒素B1含量進行測定,對提取方法中溶劑配比、料液比、超聲時間、超聲頻率進行優(yōu)化,從而得到黃曲霉毒素B1的最佳提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    苦蕎麥麩:從西昌航飛科技發(fā)展有限公司采集苦蕎麥麩皮粉。

    1.2 儀器設(shè)備

    酶標(biāo)儀,美國熱電公司生產(chǎn);MS2型微量振蕩器,德國IKA公司生產(chǎn);微量移液器,芬蘭雷勃公司生產(chǎn);超聲波細(xì)胞粉碎機,浙江寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱,上海悅豐儀器儀表有限公司生產(chǎn)。

    1.3 試劑

    ELISA試劑盒,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;甲醇、無水乙醇、三氯甲烷、分析純。

    1.4 試驗方法

    1.4.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗 將溶劑甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。在空白提取溶劑中加入不同量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品,使其每組最終濃度分別達(dá)到0.1、1.0、2.0 μg/L[1]。用ELISA法檢測,同時做5組平行。按如下公式計算:

    回收率=檢測出AFB1的含量添加入的AFB1的含量×100%。 1.4.2 樣品加標(biāo)回收試驗 將甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入 10 mL提取溶液,超聲振幅為3Φ,超聲萃取10 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液。測定原樣品中黃曲霉毒素B1的含量,按1 ∶ 1比例加入濃度分別為0.1、1.5、5.0 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品50 μL[2]。用ELISA檢測。按如下公式計算:

    回收率=總的AFB1含量-原樣品中AFB1含量添加入AFB1的量×100%。

    1.4.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響 用6 ∶ 4的甲醇作溶劑,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,按照料液比1 g ∶ 4 mL、1 g ∶ 5 mL、1 g ∶ 6 mL、1 g ∶ 7 mL、1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 9 mL加入溶劑,超聲振幅為3Φ,超聲波萃取10 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液[3],用ELISA檢測。

    1.4.4 不同超聲時間對黃曲霉毒素B1提取的影響 選用提取溶劑比6 ∶ 4和料液比1 g ∶ 5 mL進行試驗,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液,超聲波萃取,振幅為3 Φ,時間分別采用5、10、15、25、35、50 min,離心取上清液,即為待測樣品提取液[4],用ELISA檢測。

    1.4.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響 采用最佳提取溶劑6 ∶ 4、料液比1 g ∶ 5 mL、超聲時間15 min進行試驗,準(zhǔn)確稱取2.0 g苦蕎麥麩樣品,裝入25 mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL提取溶液,超聲波萃取,振幅分別為3、6、10、15、20 Φ,離心取上清液,即為待測樣品提取液。用ELISA檢測。

    1.4.6 正交試驗 根據(jù)正交試驗原理,選取料液比(A)、超聲時間(B)、超聲振幅(C)對黃曲霉毒素B1提取影響顯著的3個因素,每個因素3個水平,選用L9(33)正交表,并對數(shù)據(jù)進行極差分析,最后在一定水平范圍內(nèi)取最佳值[5]。正交試驗因素與水平設(shè)計見表 1。

    1.5 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1含量的測定

    1.5.1 樣品處理 取經(jīng)過上述超聲處理后的提取溶劑 5 mL,加入10 mL三氯甲烷,振蕩5 min,離心分層, 取出下層

    表1 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取工藝正交試驗因素水平

    水平

    因素

    A:料液比

    (g ∶ mL) B:超聲時間

    (min) C:超聲振幅

    (Φ)

    1 1 ∶ 4 10 10

    2 1 ∶ 5 15 15

    3 1 ∶ 6 20 20

    三氯甲烷相;向上層水相中再加入10 mL三氯甲烷,按上述方法重復(fù)提取1次,合并三氯甲烷相;于50 ℃下水浴蒸干;加入2 mL樣品提取液,溶解揮干物;再加入8 mL樣品稀釋液進行稀釋;取稀釋后液體待測。endprint

    1.5.2 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對應(yīng)的微孔中,加AFB1酶標(biāo)物50 μL/孔,再加入AFB1抗試劑50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置 37 ℃ 避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

    1.5.3 洗板 小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液300 μL/孔,充分洗滌5次,每次間隔30 s,用吸水紙拍干。

    1.5.4 顯色 加入底物液A液50 μL/孔,再加底物液B液50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37 ℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min。

    1.5.5 測定 加入終止液50 μL/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于雙波長D450 nm/D630 nm檢測,在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù),測定每孔D值。

    1.5.6 ELISA試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線 用ELISA標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、100、250、500、1 500、5 000 ng/L進行3次重復(fù)試驗,取平均值。利用RIDAWIN軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖 1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 空白溶劑加標(biāo)回收試驗

    ELISA檢測過程中會受到試劑、溫度、儀器靈敏度等因素的影響。為了研究提取溶劑本身對ELISA的影響,比較不同溶劑的回收率。按照“1.4.1”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取平均值。計算加標(biāo)回收率,試驗結(jié)果見表2。

    表2 空白溶劑加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    提取溶劑

    (甲醇 ∶ 水)

    添加100 ng/kg

    AFB1 1 000 ng/kg

    AFB1 2 000 ng/kg

    AFB1

    檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%) 檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%) 檢測值

    (ng/kg) 回收率

    (%)

    9 ∶ 1 81.4 81.4 1 178.1 117.8 1 933.7 96.7

    8 ∶ 2 82.5 82.5 1 196.3 119.6 1 893.3 94.7

    7 ∶ 3 88.7 88.7 967.1 96.7 1 804.3 90.2

    6 ∶ 4 109.2 109.2 877.1 87.7 1 780.2 89.0

    5 ∶ 5 114.2 114.2 924.5 92.5 2 372.2 118.6

    由表2可知,直接用不同溶劑配比進行加標(biāo)試驗,不同提取方法的回收率在81.4%~119.6%之間。根據(jù)回收率在70%~120%之間可行,結(jié)果表明,采用上述提取溶劑,并用ELISA檢測是可行的。

    2.2 樣品加標(biāo)回收試驗

    苦蕎麥麩中可能含有某些干擾物質(zhì),對提取效果會有一定干擾。為了研究樣品中干擾物質(zhì)對苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取的影響,按照“1.4.2”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取平均值,計算加標(biāo)回收率,試驗結(jié)果見表3。

    表3 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    提取溶劑

    (甲醇 ∶ 水) 稀釋10倍后樣品中

    AFB1的含量(ng/L)

    添加100 ng/L 添加1 500 ng/L 添加5 000 ng/L

    檢測值(ng/L) 回收率(%) 檢測值(ng/L) 回收率(%) 檢測值(ng/L) 回收率(%)

    9 ∶ 1 101.1 121.1 141.1 703.5 87.06 1 867.2 72.67

    8 ∶ 2 139.2 134.2 129.2 687.4 82.37 2 315.8 89.85

    7 ∶ 3 117.1 119.9 122.7 637.6 77.21 2 555.4 99.87

    6 ∶ 4 102.1 108.1 114.1 735.2 91.22 2 430.9 95.19

    5 ∶ 5 135.4 141.0 146.6 572.2 67.27 1 933.7 74.64

    由表3可知,在甲醇 ∶ 水比例為9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、5 ∶ 5時回收率均達(dá)到120%以上,不符合回收率的可行標(biāo)準(zhǔn)[6],在甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4時,回收率在91.22%~114.1%之間,最接近100%,回收率最好,即是黃曲霉毒素B1提取時,提取效果最好。因此宜采用甲醇 ∶ 水比例為6 ∶ 4的提取溶劑。

    2.3 不同料液比對黃曲霉毒素B1提取的影響

    不同的料液比對黃曲霉毒素提取有不同影響,選擇甲醇 ∶ 水比例6 ∶ 4為提取溶劑,按照“1.4.3”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值。試驗結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,在料液比為1 g ∶ 5 mL時,測得的黃曲霉毒素B1的含量最高,表明在料液比為1 g ∶ 5 mL時,提取液的提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是,當(dāng)料液比大于1 g ∶ 5 mL時,樣品與溶劑的接觸不夠,不能充分溶解,導(dǎo)致黃曲霉毒素B1提取不完全;當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶ 5 mL時,正好達(dá)到最佳溶解狀態(tài);當(dāng)料液比小于1 g ∶ 5 mL時,黃曲霉毒素B1的溶解量減少,導(dǎo)致檢測的含量減少,曲線呈下降趨勢[7]。

    2.4 不同超聲時間對黃曲霉毒素B1提取的影響

    采用不同的超聲時間對黃曲霉毒素B1進行提取,按照“1.4.4”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值。試驗結(jié)果

    見圖3。

    由圖3可知,在超聲時間為15 min時,提取的黃曲霉毒素B1含量最高,即是超聲時間為15 min時,黃曲霉毒素B1提取效果最好。當(dāng)超聲時間低于15 min或高于15 min時,檢測含量呈緩慢下降的趨勢,即黃曲霉毒素B1提取含量減少。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是在超聲時間低于15 min時,超聲強度不夠,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不完全;當(dāng)超聲時間為15 min時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取達(dá)到較為完全的狀態(tài),含量最高,提取效果最好;當(dāng)提取時間超過15 min時,由于苦蕎麥在溶劑中浸泡時間過久,導(dǎo)致苦蕎麥中黃曲霉毒素B1有少量降解的現(xiàn)象[8]。endprint

    2.5 不同超聲振幅對黃曲霉毒素B1提取的影響

    使用不同的超聲振幅進行試驗,按照“1.4.5”節(jié)方法進行5次重復(fù)試驗,取其平均值,試驗結(jié)果見圖4。

    由圖4可知,隨著超聲振幅的增加黃曲霉毒素B1的含量維持在1 064.6~1 053.7 ng/L之間,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量相對穩(wěn)定。超聲振幅在15Φ時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1含量最高,提取效果最好。產(chǎn)生該變化趨勢的原因可能是當(dāng)超聲振幅小于15Φ時,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1溶解不夠充分,造成少量差異;當(dāng)超聲振幅大于15Φ時,振幅過高造成黃曲霉毒素B1少量降解[9]。

    2.6 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗

    按照“1.4.6”節(jié)方法進行正交試驗,試驗結(jié)果如表4。

    表4 苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1提取正交試驗結(jié)果

    序號 A:料液比 B:超聲

    時間 C:超聲

    振幅 AFB1含量

    (ng/L)

    1 A1 B1 C1 1 012.5

    2 A1 B2 C2 1 037.2

    3 A1 B3 C3 1 026.9

    4 A2 B1 C2 1 041.2

    5 A2 B2 C3 1 060.8

    6 A2 B3 C1 1 038.1

    7 A3 B1 C3 1 023.1

    8 A3 B2 C1 1 051.3

    9 A3 B3 C2 1 032.8

    k1 1 025.5 1 025.6 1 034.0

    k2 1 046.7 1 049.8 1 037.1

    k3 1 035.7 1 032.6 1 036.9

    R 21.2 24.2 3.1

    由表4 分析可知,3種因素對黃曲霉毒素B1提取效果影響大小依次為B>A>C,即超聲時間>料液比>超聲振幅。根據(jù)正交試驗得到黃曲霉毒素B1含量,可以得出最優(yōu)的提取條件為A2B2C2,即料液比為1 g ∶ 5 mL,超聲時間為 15 min,超聲振幅15Φ。

    按照A2B2C2的最佳組合進行驗證試驗,同時進行3次平行試驗。用ELISA檢測后測得其含量為1 065.1 ng/L。

    3 結(jié)論

    根據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》、GB/T 18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定》中選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡浔冗M行空白加標(biāo)回收試驗,回收率在81.4%~119.6%之間,表明采用ELISA檢測黃曲霉毒素B1是可行性。

    正交試驗結(jié)果表明,超聲波提取苦蕎麥麩中黃曲霉毒素B1的最佳工藝條件為溶劑配比6 ∶ 4,料液比為1 g ∶ 5 mL,超聲時間為15 min,超聲振幅15Φ。在此條件下提取黃曲霉毒素B1的含量為1 065.1 ng/L,高于同等條件下常規(guī)提取含量 1 055.0 ng/L。

    此外,苦蕎麥中黃曲霉毒素B1提取方法中因內(nèi)部提取溶劑及外部環(huán)境因素等要求復(fù)雜,影響提取因素多,在實際工作中還應(yīng)做其他條件的優(yōu)化,如溶劑、溫度、濕度、pH值等,因工作量大而時間有限,本試驗僅對苦蕎麥中黃曲霉毒素B1作初步的優(yōu)化設(shè)計。

    參考文獻(xiàn):

    [1]程 靜,高學(xué)軍,劉曉飛,等. 反相高效液相色譜法檢測牛初乳乳鐵蛋白的方法研究[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2009,32(1):30-32,34.

    [2]趙曉聯(lián),趙春城,鈕偉民,等. 酶聯(lián)免疫吸附法測定黃曲霉毒素B1

    誤差分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2001,11(4):473-474.

    [3]張海濤,陸廷瑾,蔣 飛,等. ELISA法檢測玉米中AFB1樣品提取方法改進的研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,32(5):58-60.

    [4]何建中. 459份花生油中黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果分析[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,31(8):127.

    [5]王 磊. 黃曲霉毒素B1免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究[D]. 洛陽:河南科技大學(xué),2001.

    [6]孫秀蘭,趙曉聯(lián),湯 堅. 大米中黃曲霉毒素B1的提取方法優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2004,25(7):128-131.

    [7]劉媛婷. 霉菌毒素吸附劑對黃曲霉毒素B1吸附特性及效果研究[D]. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    [8]陳志娟,劉 陽,邢福國,等. 氨氣熏蒸降解玉米中黃曲霉毒素B1的條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2010,31(8):33-37.

    [9]陳憲明,張坊秋,陳 惠,等. 變黃米污染黃曲霉毒素B1規(guī)律的研究[J]. 糧食儲藏,1985,23(3):32-40.endprint

    猜你喜歡
    提取
    射擊痕跡的尋找和提取
    法制博覽(2016年12期)2016-12-28 18:50:33
    植物基因組DNA提取
    濱州市沾化冬棗核中活性多糖的提取
    綠色科技(2016年20期)2016-12-27 18:10:47
    茶色素生物活性及制備技術(shù)研究進展
    木犀草素提取工藝的研究概況
    現(xiàn)場勘查中物證的提取及應(yīng)用
    淺談涂料墻面上汗液手印的顯現(xiàn)和提取
    土壤樣品中農(nóng)藥殘留前處理方法的研究進展
    中學(xué)生開展DNA“細(xì)”提取的實踐初探
    淺析城市老街巷景觀本土設(shè)計元素的提取與置換
    亚洲精品在线观看二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 大香蕉久久网| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久大精品| 少妇的逼水好多| 亚洲精品国产成人久久av| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲成av人片在线播放无| av女优亚洲男人天堂| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 在现免费观看毛片| 少妇的逼好多水| 22中文网久久字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 精品日产1卡2卡| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩欧美在线乱码| 最近2019中文字幕mv第一页| www.色视频.com| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人二区视频| 久久韩国三级中文字幕| 三级经典国产精品| 成年av动漫网址| 日本a在线网址| 亚洲成人精品中文字幕电影| 色5月婷婷丁香| 色视频www国产| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美一区二区亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 又爽又黄a免费视频| 性色avwww在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av五月六月丁香网| 日本在线视频免费播放| 99riav亚洲国产免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产精品国产精品| 国产精华一区二区三区| 天堂动漫精品| 黄色日韩在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产亚洲精品久久久com| 日韩欧美三级三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 波多野结衣巨乳人妻| 免费看av在线观看网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 最好的美女福利视频网| 国产探花极品一区二区| 一本精品99久久精品77| 51国产日韩欧美| 亚洲av成人av| 97在线视频观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产亚洲精品久久久com| 精品久久国产蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品成人久久久久久| 天堂√8在线中文| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 嫩草影院精品99| 亚洲综合色惰| 久久久成人免费电影| 久久人人精品亚洲av| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产亚洲欧美98| 99久久精品国产国产毛片| 国产成人福利小说| 婷婷六月久久综合丁香| 国产免费一级a男人的天堂| 特级一级黄色大片| 中文在线观看免费www的网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av在线播放精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品久久久久久久久亚洲| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜久久久久精精品| 久久国内精品自在自线图片| 嫩草影院新地址| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久久久成人| 精品日产1卡2卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品,欧美在线| 婷婷精品国产亚洲av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美精品国产亚洲| 欧美一区二区精品小视频在线| 真人做人爱边吃奶动态| 女人被狂操c到高潮| 久久午夜福利片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 97碰自拍视频| 搞女人的毛片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 舔av片在线| www.色视频.com| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品一区www在线观看| 欧美激情在线99| 欧美一区二区亚洲| 免费高清视频大片| www日本黄色视频网| 国产极品精品免费视频能看的| 精品不卡国产一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲图色成人| 精品午夜福利视频在线观看一区| 午夜激情福利司机影院| 禁无遮挡网站| 国产成人a∨麻豆精品| 观看美女的网站| 久久久久久大精品| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品,欧美在线| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品在线观看二区| 插逼视频在线观看| 在线a可以看的网站| 白带黄色成豆腐渣| 国产午夜精品论理片| 天堂网av新在线| 99久久成人亚洲精品观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 91精品国产九色| 简卡轻食公司| 一本久久中文字幕| av视频在线观看入口| 18禁在线播放成人免费| 午夜福利在线观看吧| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品永久免费网站| 晚上一个人看的免费电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲无线观看免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 高清午夜精品一区二区三区 | 搡老妇女老女人老熟妇| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 少妇高潮的动态图| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色尼玛亚洲综合影院| 最新在线观看一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 欧美激情在线99| 国产黄色小视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 神马国产精品三级电影在线观看| av.在线天堂| 亚洲av二区三区四区| 免费av观看视频| 观看免费一级毛片| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 性欧美人与动物交配| 99热全是精品| 久久久色成人| 国内精品宾馆在线| 国产中年淑女户外野战色| 久久九九热精品免费| av卡一久久| 男女之事视频高清在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 九色成人免费人妻av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 在线a可以看的网站| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲欧美日韩东京热| 少妇的逼水好多| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av不卡在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩av在线大香蕉| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 麻豆国产97在线/欧美| 国产av不卡久久| 日韩三级伦理在线观看| 香蕉av资源在线| 婷婷六月久久综合丁香| 一a级毛片在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| av在线观看视频网站免费| 国产男靠女视频免费网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 日日啪夜夜撸| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩av不卡免费在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 国产三级在线视频| 色在线成人网| 男人舔女人下体高潮全视频| 少妇丰满av| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 一夜夜www| 天堂√8在线中文| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 色尼玛亚洲综合影院| 国内精品宾馆在线| 日本一二三区视频观看| 99在线视频只有这里精品首页| 成人av在线播放网站| 桃色一区二区三区在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美3d第一页| 天堂网av新在线| 国产乱人偷精品视频| 日韩成人伦理影院| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕熟女人妻在线| 在线播放无遮挡| 久久久久久九九精品二区国产| 乱系列少妇在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 国产成人福利小说| 亚洲av.av天堂| 男女之事视频高清在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 天堂√8在线中文| 成人漫画全彩无遮挡| 我要看日韩黄色一级片| 日韩欧美免费精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费观看的影片在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 色av中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 看免费成人av毛片| 精品熟女少妇av免费看| 午夜影院日韩av| 亚洲av美国av| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品伦人一区二区| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 99久久九九国产精品国产免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 丰满的人妻完整版| 麻豆久久精品国产亚洲av| 又黄又爽又免费观看的视频| 全区人妻精品视频| 久久久午夜欧美精品| 少妇丰满av| 亚洲18禁久久av| 国产精品精品国产色婷婷| av卡一久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美成人精品欧美一级黄| 99热这里只有是精品50| 91在线观看av| 亚洲最大成人中文| 国产精品1区2区在线观看.| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一a级毛片在线观看| 天堂√8在线中文| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 一级毛片我不卡| 国产欧美日韩一区二区精品| 成人av在线播放网站| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品永久免费网站| 直男gayav资源| 成人鲁丝片一二三区免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费黄网站久久成人精品| 禁无遮挡网站| 热99re8久久精品国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲最大成人手机在线| 又爽又黄无遮挡网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| av在线亚洲专区| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产三级中文精品| 日本五十路高清| 亚州av有码| 性插视频无遮挡在线免费观看| 午夜爱爱视频在线播放| 99热这里只有精品一区| 成人综合一区亚洲| 小说图片视频综合网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久99热这里只有精品18| 欧美日韩乱码在线| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 伦精品一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 男人舔奶头视频| 亚洲综合色惰| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 一级黄片播放器| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 婷婷亚洲欧美| 久久人人精品亚洲av| 我的女老师完整版在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 日本成人三级电影网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久国产乱子免费精品| 亚州av有码| 午夜老司机福利剧场| 99热这里只有精品一区| 91在线观看av| 国产成人精品久久久久久| 草草在线视频免费看| 观看美女的网站| 一进一出抽搐动态| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 村上凉子中文字幕在线| 久久精品影院6| 在线观看午夜福利视频| 免费看av在线观看网站| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲va在线va天堂va国产| 性欧美人与动物交配| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 中国美女看黄片| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 简卡轻食公司| 久久久久久久久久久丰满| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久久久久大av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲不卡免费看| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产三级在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| 能在线免费观看的黄片| 真实男女啪啪啪动态图| 在线天堂最新版资源| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久久国产成人免费| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本熟妇午夜| 久久久久久久久大av| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 不卡一级毛片| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一进一出抽搐动态| 午夜免费激情av| 成年免费大片在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 不卡视频在线观看欧美| 一级a爱片免费观看的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费看av在线观看网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| avwww免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本在线视频免费播放| av福利片在线观看| 免费av毛片视频| 一本久久中文字幕| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久久欧美国产精品| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久久伊人网av| 性色avwww在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 婷婷亚洲欧美| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕久久专区| 日韩一本色道免费dvd| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 97在线视频观看| 久久久国产成人精品二区| 看十八女毛片水多多多| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 12—13女人毛片做爰片一| 男女边吃奶边做爰视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色综合色国产| 在线免费观看的www视频| 亚洲成av人片在线播放无| 99视频精品全部免费 在线| 久久久久久久久久黄片| 简卡轻食公司| 成年版毛片免费区| 热99在线观看视频| 久99久视频精品免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| www.色视频.com| 能在线免费观看的黄片| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲精品色激情综合| 亚洲一区高清亚洲精品| 小说图片视频综合网站| 久久久久久伊人网av| 99热6这里只有精品| 国产精品不卡视频一区二区| 一进一出好大好爽视频| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩欧美在线乱码| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 波多野结衣高清作品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色5月婷婷丁香| 亚洲av免费在线观看| 秋霞在线观看毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 99在线人妻在线中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 日本成人三级电影网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看免费视频日本深夜| 国产一区二区激情短视频| 精品久久久久久成人av| 三级国产精品欧美在线观看| 深爱激情五月婷婷| av黄色大香蕉| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一本久久中文字幕| 亚洲无线观看免费| 午夜a级毛片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 97超碰精品成人国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99久久精品国产国产毛片| 伦精品一区二区三区| 99久久中文字幕三级久久日本| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲性久久影院| 色吧在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品人妻久久久影院| 秋霞在线观看毛片| .国产精品久久| 我要搜黄色片| 天堂网av新在线| 免费看a级黄色片| 日韩亚洲欧美综合| 黄色一级大片看看| 日韩三级伦理在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99九九线精品视频在线观看视频| 午夜久久久久精精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男人和女人高潮做爰伦理| 大香蕉久久网| 久久精品影院6| 午夜福利成人在线免费观看| 在线观看av片永久免费下载| 日韩av在线大香蕉| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精品一区二区三区人妻视频| 一区二区三区四区激情视频 | 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 毛片女人毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区在线av高清观看| 人妻久久中文字幕网| 午夜福利在线在线| 在线免费十八禁| 欧美最新免费一区二区三区| 嫩草影院精品99| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品久久久久久久久亚洲| 一级黄片播放器| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 俺也久久电影网| 久久鲁丝午夜福利片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 99热网站在线观看| 久久草成人影院| 此物有八面人人有两片| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高清不卡午夜福利| 狠狠狠狠99中文字幕| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 岛国在线免费视频观看| 在线播放无遮挡| 黑人高潮一二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 韩国av在线不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久午夜欧美精品| 毛片女人毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 成人无遮挡网站| 三级经典国产精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91狼人影院| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产一区二区激情短视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 搡老岳熟女国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美性猛交黑人性爽| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人三级黄色视频| 欧美3d第一页| 久久人人精品亚洲av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 婷婷亚洲欧美| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日本成人三级电影网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产成人影院久久av| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产精品成人久久小说 | 中文在线观看免费www的网站| 深夜a级毛片| 韩国av在线不卡| 国产真实伦视频高清在线观看| 中出人妻视频一区二区| 黄片wwwwww| 精品久久久久久成人av| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久久久国产网址| 91久久精品国产一区二区成人| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久久久久久成人| av在线天堂中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久人人爽人人片av| 身体一侧抽搐| 成人av在线播放网站| 大型黄色视频在线免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲人成网站在线播| 色吧在线观看| 精品久久久噜噜| 哪里可以看免费的av片| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲内射少妇av| 欧美高清成人免费视频www| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 淫秽高清视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人午夜高清在线视频|