PGD2對小鼠肺成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響

劉建英，劉代順，劉振峰，韓冰

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000)

支氣管哮喘是由多種細胞(如肥大細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，其特征是可逆的氣流受限。過去的研究主要集中在支氣管哮喘的氣道炎癥。近年大量研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者經常出現(xiàn)不可逆或部分不可逆性氣流阻塞及持續(xù)的氣道高反應性，即使給予積極的抗炎和擴張支氣管治療仍無效，認為其原因與長期氣道慢性炎癥直接或間接引起氣道壁結構改變有關，氣道壁的這種結構改變稱為氣道重構，被認為是除氣道慢性炎癥之外哮喘的另一個重要特征［1］。2010年6月～2011年12月，本實驗通過探討前列腺素D2(PGD2)對小鼠肺成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響，為支氣管哮喘氣道重塑提供分子研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 L-929小鼠肺成纖維細胞(第四軍醫(yī)大學提供)，胎牛血清、TGF-β2細胞因子、PGD2受體抑制劑Laropiprant(均購買于 Gibco公司，USA)，TRIzol、PCR試劑盒(均購買于大連寶生物公司)，多克隆兔 TGF-β1抗、多克隆兔 Smad3抗、多克隆兔Smad4抗(美國CsT公司)，單克隆鼠β-actin(碧云天)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記的兔抗鼠二抗、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、彩色預染蛋白相對分子質量標準(均購于碧云天)，瓊脂糖(Biowest公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測細胞活力 參照中國國家標準GB/T1688615-1997“醫(yī)療器械生物學評價第五部分:細胞毒性試驗體外法”進行。將生長狀態(tài)良好的L-929細胞于實驗前1 d傳代，第2天用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調整細胞為2×105/mL，鋪于96孔平底板中37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，待細胞貼壁后，即將實驗細胞按照時間梯度分為12 h組、24 h組、48 h 組、72 h、96 h 組，分別用 10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋Laropiprant(稀釋濃度為 0.3、1、3、10、30 μmol/mL)，同時設正常細胞對照，每孔加入100 μL試液，每個稀釋度設5個復孔，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔(每毫升 PBS 中溶解 5 mg MTT，經0.22 μL濾膜濾過以除菌和去不溶物質，低溫、避光保存)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，用預溫的PBS清洗2遍，棄去上清，加入溶解液DMSO 100 μL/孔，于微型振蕩器上振蕩5 min，使結晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處測定各孔吸光度(OD)值。根據測定的OD值計算其相對的細胞生長抑制率。抑制率=［(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值］×100%。

1.2.2 RT-PCR 法檢測 TGF-β1、Smad3、Smad4 的mRNA 將對數(shù)生長期的L-929細胞以5×104/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶內，接種24 h，按Laropiprant濃度梯度將細胞分為空白對照組、0 μmol/mL 組、0.3 μmol/mL 組、1 μmol/mL 組、3 μmol/mL 組、10 μmol/mL組，除空白對照組外，每組分別加入2.5 ng/mL TGF-β2，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，用 TRIzol 法提取細胞總RNA，根據PCR試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)進行PCR。逆轉錄反應體系:10×RNA PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Oligo dT 50 pmol，Rnasin 20 U，逆轉錄酶 5 U，cDNA 10 μL，補加 DEPC 處理水至 20 μL。于熱循環(huán)儀中95℃預變性5 min，再進行95℃變性1 min、57℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)。最后將PCR產物進行溴化乙錠染色，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。用凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像。LABWORKS分析軟件對擴充基因的電泳條帶進行灰度分析。光密度表示為實驗值/β-actin，分別進行3次取平均值。各檢測指標引物序列:TGF-β1:上游 5'-CGGAATTCATGGTCCACAGCATTCCGCTG-3'，下游5'-CGGGATCCCTAATTGATCCCGCTGCTCA-3';Smad3:上游 5'-TGAACACCAAGTGCATTACCA-3'，下游5'-GGAGGTAGAACTGGCGTCTCT-3';Smad4:上游5'-ACATTGGATGGACGACTTCAG-3'，下游 5'-TCAATTCCAGGTGAGACAACC-3'。

1.2.3 Western blotting 法 檢 測 TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達量 按Laropiprant濃度梯度將細胞分為空白對照組、0 μmol/mL 組、0.3 μmol/mL 組、1 μmol/mL組、3 μmol/mL組，除空白對照組外每組分別加入2.5 ng/mL TGF-β2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取總蛋白，BCA法測定濃度。以每孔40 mg上樣，用10%的聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉移至PVDF膜，稀釋多克隆兔 TGF-β1抗(1∶500)、多克隆兔Smad3 抗(1∶500)、多克隆兔 Smad4 抗(1∶500)，單克隆鼠β-actin(1∶500)4℃孵育過夜，洗膜后，HRP標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)、HRP標記的兔抗鼠二抗(1∶1 000)孵育6 h，用發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，使用Gensnap凝膠成像系統(tǒng)拍照。光密度=實驗值/βactin，分別進行3次取平均值。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 Laropiprant對小鼠肺成纖維細胞活力的影響細胞生長抑制率隨Laropiprant濃度增高和作用時間延長呈上升趨勢，Laropiprant在濃度達到1 μmol/mL，作用時間為24～96 h時，細胞生長抑制率明顯提高(見圖1)。

圖1 Laropiprant對小鼠肺成纖維細胞活力的影響

2.2 PGD2對小鼠肺成纖維細胞 TGF-β1的影響 如圖2A、2B所示，當加入PGD2刺激劑TGF-β2后在小鼠成纖維細胞中TGF-β1mRNA及蛋白表達增加;但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細胞TGF-β1mRNA及蛋白表達逐漸降低，與 Laropiprant 0 μmol/mL 組相比，Laropiprant 1、3、10 μmol/mL 組TGF-β1mRNA 及蛋白降低(P 均 ＜0.05)。

圖2 PGD2對小鼠肺成纖維細胞TGF-β1的影響

2.3 PGD2對小鼠肺成纖維細胞Smad3的影響 如圖3A、3B所示，當加入TGF-β2后，小鼠肺成纖維細胞Smad3 mRNA及蛋白表達增加，但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細胞Smad3 mRNA及蛋白表達逐漸降低，與 Laropiprant 0 μmol/mL組相比，Laropiprant對Smad3 mRNA及蛋白的抑制在Laropipratnt 0.3、3 μmol/mL 組增強(P 均 ＜0.05)。

圖3 PGD2對小鼠肺成纖維細胞Smad3的影響

2.4 PGD2對小鼠肺成纖維細胞Smad4的影響如圖4A、4B所示，當加入TGF-β2后，小鼠肺成纖維細胞Smad4 mRNA及蛋白表達增加，但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細胞Smad4 mRNA及蛋白表達逐漸降低，與Laropiprant 0 μmol/mL組相比，Laropiprant對Smad4 mRNA及蛋白的抑制在Laropiprant 3、10 μmol/mL 組增強(P 均 ＜0.05)。

3 討論

近年來，支氣管哮喘氣道重構越來越受到重視，但引起和加重哮喘氣道重構的因素還不完全了解。目前研究表明，PGD2對哮喘免疫反應起著雙向調控作用，可作為炎癥介質產生致炎作用。Song等［2］在支氣管哮喘患者吸入塵螨后，對其支氣管肺泡灌洗液進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中的PGD2濃度可增加15倍。PGD2不僅誘導了支氣管收縮，并且促使支氣管收縮的效應強于組胺30倍。在支氣管哮喘患者受到抗原的刺激后，其氣道內存在大量PGD2。Sedej等［3］通過培養(yǎng)人胎兒肺成纖維細胞(HFL-1)進行體外實驗，證明了PGD2不僅抑制HFL-1對人纖連蛋白起趨化作用的因子，而且還可以減緩成纖維細胞的遷移，主要是通過Ca2+依賴的蛋白激酶A信號通路來發(fā)揮作用。在氣道炎癥損傷后修復過程中，成纖維細胞太少不利于損傷的修復，而成纖維細胞過多則會使組織結構發(fā)生改變，從而使氣道相應功能喪失。

圖4 PGD2對小鼠肺成纖維細胞Smad4的影響

Murata 等［4］的研究表明，TGF-β1在氣道炎癥和纖維化中發(fā)揮了重要作用，其是刺激成纖維細胞增殖及膠原分泌的主要細胞因子。有學者在支氣管哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)TGF-β1水平顯著高于健康對照組，變應原刺激24 h后的TGF-β1水平更高;同時采用原位雜交和免疫細胞化學方法檢測患者的哮喘氣道黏膜，發(fā)現(xiàn)其TGF-β1表達顯著增加和免疫反應顯著增強，增加的量和疾病的嚴重程度直接相關。Schwartz等［5］在研究PGD2/DP信號轉導對支氣管哮喘發(fā)生的作用時發(fā)現(xiàn)，PGD2/DP信號不僅能抑制成纖維細胞的遷移，也可以調整成纖維細胞介導前膠原纖維的收縮反應。本實驗以小鼠肺成纖維細胞為研究對象，通過應用PGD2特異性刺激劑TGF-β2刺激細胞，運用RT-PCR和Western blotting來檢測 TGF-β1、Smad3、Smad4 的表達，結果發(fā)現(xiàn)隨著刺激劑 TGF-β2的濃度增加，細胞TGF-β1、Smad3、Smad4 的表達升高;但加入 Laropiprant后，隨著其濃度增加，細胞 TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA及蛋白表達逐漸降低;與Laropiprant 0 μmol/mL組比較差異有統(tǒng)計學意義。提示在小鼠氣道慢性炎癥過程中，PGD2可能對細胞TGF-β1、Smad3、Smad4的表達具有調控作用，這種機制在慢性氣道炎癥引起的氣道重構中可能發(fā)揮了至關重要的作用。但是本實驗仍未涉及其具體調控機制的研究，此外，在活體復雜環(huán)境下，PGD2對 TGF-β1/Smads的調控規(guī)律也有待進一步研究。

［1］Nagashima H，Nakamura Y，Kanno H，et al.Effect of genetic variation of IL-13 on airway remodeling in bronchial asthm［J］.Allergol Int，2011，60(3):291-298.

［2］Song WL，Stubbe J，Ricciotti E，et al.Niacin and biosynthesis of PGD2by platelet COX-1 in mice and humans［J］.J Clin Invest，2012，112(4):1459-1468.

［3］Sedej M，Schr?der R，Bell K，et al.D-type prostanoid receptor enhances the signaling of chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T(H)2cells［J］.J Allergy Clin Immunol，2012，129(2):492-500.

［4］Murata T，Aritake K，Tsubosaka Y，et al.Anti-inflammatory role of PGD2in acute lung inflammation and therapeutic application of its signal enhancement［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110(13):5205-5210.

［5］Schwartz JI，Liu F，Wang YH，et al.Effect of laropiprant，a PGD2receptor 1 antagonist，on estradiol and norgestimate pharmacokinetics after oral contraceptive administration in women［J］.Am J Ther，2009，16(6):487-495.