青貯飼料用乳酸菌的高密度培養(yǎng)優(yōu)化

焦月華，張 爽，黃曉峰，姜 波，趙良友

（1.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150025）

青貯飼料是把青飼料切碎后裝入青貯塔或青貯窖內(nèi)密封，添加乳酸菌發(fā)酵劑或酶制劑后，發(fā)酵制成。青貯飼料的質(zhì)量直接影響反芻動物的生產(chǎn)性能，而青貯飼料中乳酸菌對其質(zhì)量起決定作用。國外許多研究者對乳酸菌在青貯飼料制備中的作用和應(yīng)用進(jìn)行了大量深入的研究[1-2]。而我國在青貯添加劑技術(shù)的研究與應(yīng)用方面十分薄弱，在東北地區(qū)乳酸菌添加劑在全株玉米青貯飼料中的應(yīng)用尤其少見。直投式發(fā)酵劑是一種不需要經(jīng)過活化和擴(kuò)培便能直接應(yīng)用于生產(chǎn)的發(fā)酵劑，具有保藏周期長、活菌數(shù)高和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，能夠提高應(yīng)用效率和產(chǎn)品質(zhì)量[3]。在乳制品工業(yè)的實際生產(chǎn)過程中，通常選用以脫脂乳粉或乳清粉作為主要成分的增殖培養(yǎng)基來生產(chǎn)用于乳制品發(fā)酵的直投式發(fā)酵劑，這樣能夠有效改善菌種因適應(yīng)新環(huán)境而導(dǎo)致的生長遲緩，例如可以利用乳清粉或者乳清滲出液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過補充一些碳源、氮源以及緩沖鹽類作為增殖培養(yǎng)基來進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。乳清作為干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物，主要成分是大量的乳糖和乳清蛋白，此外還含有豐富的必需氨基酸、礦物質(zhì)和B族維生素，不但能夠滿足乳酸菌的生長需要，而且來源廣泛、價格低廉，非常適合作為工業(yè)化原料來生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑[4]。目前，國內(nèi)外已有大量關(guān)于以廉價乳清基質(zhì)作為乳酸菌增殖培養(yǎng)基的主要成分來生產(chǎn)乳制品發(fā)酵劑的報道，但是利用其來生產(chǎn)青貯用乳酸菌發(fā)酵劑仍鮮有報道[5-6]。本研究以前期從黑龍江省內(nèi)采集的自然發(fā)酵優(yōu)質(zhì)青貯飼料中分離并篩選得到的1株優(yōu)良植物乳桿菌（Lp1）作為研究對象，以乳清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備菌體細(xì)胞的濃縮培養(yǎng)物，優(yōu)化發(fā)酵條件的同時采用單因素和正交實驗，比較額外添加的碳源和氮源對乳酸菌增殖的影響，從而為青貯飼料用乳酸菌直投式發(fā)酵劑工業(yè)用培養(yǎng)基的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株來源

植物乳桿菌Lp1分離自優(yōu)質(zhì)的青貯玉米飼料，經(jīng)前期試驗已初步確定具有較強的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸速率，可用于青貯飼料制作。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

乳清粉購自新西蘭，酵母粉、酪蛋白胨購自英格蘭Oxoid公司，谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，葡萄糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，Tween-801 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 L，pH 5.8～6.0，121℃滅菌15 min[7]。

6%（W/V）乳清培養(yǎng)基：乳清粉6 g溶于70℃100 mL蒸餾水中，用1 mol·L-1HCL調(diào)至pH 4.5，室溫下經(jīng)8000 rpm，高速離心30 min除去析出的酪蛋白，澄清的乳清液再用1 mol·L-1NaOH調(diào)回pH 6.5，110℃滅菌10 min備用。

6%（W/V）乳清培養(yǎng)基+0.75%磷酸鹽培養(yǎng)基：在6%（W/V）乳清培養(yǎng)基中加入0.75%磷酸鹽，其中磷酸鹽溶液為KH2PO4∶Na2HPO4=1∶1（V/V），110℃滅菌10 min備用[8]。

1.1.3 儀器和設(shè)備

超速冷凍離心機GL-21M購自上海離心機械研究所；培養(yǎng)箱DHP-P272購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡購自美國OLMPUS；超凈工作臺VD-1320購自哈東聯(lián)儀器設(shè)備制造公司；核酸/蛋白質(zhì)分析儀DU-800購自美國Beckman。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化

將實驗室保存的植物乳桿菌Lp1接入到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每24 h傳代1次，均按照1.5%接種量接種，活化兩次。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

將活化后的植物乳桿菌Lp1以3%（v/v）的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，通過測定OD600nm來比較不同溫度（37、42、45℃）及初始pH（pH 5.8、pH 6.2、pH 6.6）對其增殖效果的影響。

1.2.3 碳氮源對乳酸菌生長的影響

比較碳氮源種類對植物乳桿菌Lp1生長的影響，在6%乳清+0.75%磷酸鹽培養(yǎng)基中分別添加0.7%（W/V）氮源（大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白胨）或2%（W/V）的碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖），以活菌數(shù)來反映不同碳氮源種類對植物乳桿菌Lp1增殖效果的影響[9]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

考慮到營養(yǎng)物質(zhì)之間存在的聯(lián)合協(xié)同作用，在6%乳清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的正交實驗法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，其中碳源和氮源的因素水平設(shè)計根據(jù)前面的研究結(jié)果確定。另外，根據(jù)文獻(xiàn)選擇酵母粉作為第3個因素[8,10-11]。通過活菌數(shù)來確定最佳的增菌培養(yǎng)基配方。

1.2.5 菌體培養(yǎng)和活菌計數(shù)方法

將植物乳桿菌Lp1以3%（V/V）的接種量接種到培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)14 h（穩(wěn)定期初期）后，利用梯度稀釋平板活菌計數(shù)法，將涂布后的平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計活菌數(shù)[12]。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對增殖效果的影響

溫度對乳酸菌增殖的影響見圖1。

圖1 溫度對乳酸菌增殖的影響

微生物的生長繁殖是一系列生化反應(yīng)的結(jié)果，菌株的生長速率和酶活性與培養(yǎng)溫度具有一定的依存關(guān)系，使得發(fā)酵的最適溫度隨菌株的不同而不同。由圖1可見，乳酸菌在37～45℃溫度范圍內(nèi)生長均有2 h的生長遲滯期，尤其是經(jīng)37℃培養(yǎng)時的生長曲線低于45℃培養(yǎng)（P＜0.05），8 h時，在42和45℃下培養(yǎng)的菌體細(xì)胞的吸光度幾乎沒有差別，因此出于節(jié)約能源的角度考慮，選擇42℃作為植物乳桿菌Lp1高密度培養(yǎng)的溫度。

初始pH對乳酸菌增殖的影響見2。

圖2 初始pH對乳酸菌增殖的影響

由圖2可知，乳酸菌在不同初始pH培養(yǎng)環(huán)境下的增殖趨勢為：前0～2 h內(nèi)均處于生長遲滯期，此后乳酸菌一直呈現(xiàn)快速生長狀態(tài)。雖然乳酸菌經(jīng)初始pH 6.2～6.6培養(yǎng)的生長速率顯著高于初始pH 5.8培養(yǎng)時的生長速率（P＜0.05），但是當(dāng)培養(yǎng)基初始酸度高于pH 6.2時，乳酸菌的增殖趨勢并沒有顯著升高（P＞0.05）。因為植物乳桿菌Lp1將來作為青貯飼料發(fā)酵劑使用，為了讓其能夠迅速適應(yīng)青貯飼料的酸性環(huán)境而開始快速增殖，從而抑制腐敗菌的生長，植物乳桿菌Lp1高密度增殖培養(yǎng)基的酸度調(diào)節(jié)為pH 6.2比較適合。

2.2 不同碳源對乳酸菌生長的影響

不同碳源對植物乳桿菌Lp1增殖的影響見圖3。

圖3 不同碳源對植物乳桿菌Lp1增殖的影響

如圖3所示，蔗糖的增殖效果顯著低于乳糖和葡萄糖（P＜0.05），這是由于大多數(shù)的乳酸菌不具有分解二糖和多糖等大分子碳水化合物相關(guān)酶系的能力。葡萄糖是絕大多數(shù)乳酸菌最容易吸收和利用的單糖，植物乳桿菌Lp1也不例外，同時，葡萄糖和乳糖都能夠顯著地促進(jìn)植物乳桿菌Lp1的增殖（P＜0.05）。

2.3 不同氮源對乳酸菌生長的影響

不同氮源對植物乳桿菌Lp1增殖的影響見圖4。

圖4 不同氮源對植物乳桿菌Lp1增殖的影響

由圖4可知，植物乳桿菌Lp1最適宜的氮源為牛肉膏，而蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨和胰蛋白胨的增菌效果相近。這是由于牛肉膏中含有多種核苷酸、多肽、有機酸和具有高緩沖能力的磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于滿足微生物生長多方面的要求[13]。考慮到成本，選擇價格較低廉的蛋白胨和大豆蛋白胨，這兩種氮源的增菌效果也較好，植物乳桿菌Lp1的活菌數(shù)達(dá)1.02×109cfu·mL-1。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

優(yōu)化培養(yǎng)基的正交實驗結(jié)果見附表。

附表 優(yōu)化培養(yǎng)基的正交實驗結(jié)果

由附表可知，影響Lp1的主次順序是B＞A＞C，蛋白胨的效果最佳，葡萄糖次之，影響最小的為酵母粉，最佳保護(hù)劑配方為A3B3C3，但是優(yōu)化出的最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交實驗組，為了進(jìn)一步確定正交實驗的準(zhǔn)確性，在相同條件下，對A3B3C3組合與A3B3C2組合進(jìn)行1次驗證實驗。結(jié)果表明，植物乳桿菌Lp1的活菌數(shù)為3.23×109cfu·mL-1，高于試驗組的最高活菌數(shù)，因此確定A3B3C3為最佳的培養(yǎng)基配方組合，即6%乳清、3%葡萄糖、1.0%蛋白胨和1.0%酵母粉（均為W/V）。

3 討論

乳酸菌直投式發(fā)酵劑的相關(guān)研究在國內(nèi)已經(jīng)不是一個新興的領(lǐng)域，但是國內(nèi)的食品行業(yè)所使用的直投式發(fā)酵劑都被外資企業(yè)所壟斷[14]。因此，生產(chǎn)出優(yōu)良的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的直投式發(fā)酵劑，不僅能夠打破國外企業(yè)的技術(shù)壁壘，還因其較低的成本具有巨大的市場潛力[15]。在發(fā)酵結(jié)束之后，乳酸菌的菌數(shù)越多，經(jīng)過濃縮和凍干損失之后的直投式發(fā)酵劑中的活菌數(shù)才會越高，因此，高密度發(fā)酵是決定直投式乳酸菌發(fā)酵劑質(zhì)量的重要因素[16]。乳清粉作為干酪生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，其來源廣泛、價格低廉[17]。許多研究表明，乳清粉可作為乳酸菌增殖培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，能夠獲得高濃度的菌體細(xì)胞，并且顯著降低生產(chǎn)成本（P＜0.05）[5-6,8]。由于其主要成分是乳清蛋白和乳糖，而乳酸菌的大量增殖需要許多生長因子，且乳清培養(yǎng)基的pH緩沖能力也稍弱，因此，作為乳酸菌高密度培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基需加入緩沖鹽類，從而將發(fā)酵液的酸度控制在一定范圍內(nèi)，同時需要根據(jù)不同乳酸菌菌株的具體營養(yǎng)需求添加適宜的生長因子和額外的碳氮源等其他成分，以利于菌體細(xì)胞的大量增殖而獲得高濃度的菌體培養(yǎng)液[18]。酵母粉中含有大量輔酶與核酸的組成成分，例如氨基酸類、肽類和B族維生素等，有利于乳酸菌菌株的快速高密度增殖[13]。Dean等發(fā)現(xiàn)，在乳清中添加1%酵母粉（W/V）能夠顯著增加德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842的β-半乳糖苷酶的活力，從而促進(jìn)其對乳糖的分解，提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)（P＜0.05）[19]。陳雪等研究發(fā)現(xiàn)，向乳清培養(yǎng)基中添加酵母粉和酶水解酪蛋白能夠顯著提高發(fā)酵液中乳酸乳球菌菌株KLDS 4.0424的活菌數(shù)（P＜0.05）[6]。因此，本研究也利用6%的乳清磷酸鹽緩沖液培養(yǎng)基，選擇通過添加酵母粉、葡萄糖和蛋白胨來制備植物乳桿菌Lp1的增菌培養(yǎng)基，達(dá)到了較好的結(jié)果。

4 結(jié) 論

通過單因素和正交實驗篩選出最佳的增菌培養(yǎng)基的成分為6%乳清、3%葡萄糖、1.0%蛋白胨和1.0%酵母粉，發(fā)酵液中的活菌數(shù)能夠達(dá)到3.23×109cfu·mL-1。

[1]ávila C L S,Valeriano A R,Pinto J C,et al.Chemical and micro?biological characteristics of sugar cane silages treated with micro?bial inoculants[J].Revista Brasileira de Zootecnia,2010,39（1）:25-32.

[2]Filya I.The effect of Lactobacillus buchneri,with or without homo?fermentative lactic acid bacteria,on the fermentation,aerobic sta?bility and ruminal degradability of wheat,sorghum and maize si?lages[J].Journal of Applied Microbiology,2003,95（5）:1080-1086.

[3]孟祥晨,杜鵬,李艾黎.乳酸菌與乳品發(fā)酵劑[M].北京:科學(xué)出版社,2009.

[4]郭本恒.乳品化學(xué)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2001.

[5]鄧鵬超.乳酸菌的高密度培養(yǎng)及酸奶凍干發(fā)酵劑的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[6]陳雪,王偉,楊麗杰.乳酸乳球菌直投式發(fā)酵劑乳清增菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品科技,2013,38（4）:11-16.

[7]凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.

[8]李艾黎,代敏,霍貴成.利用乳清培養(yǎng)基生產(chǎn)乳品發(fā)酵劑的研究[J].食品科學(xué),2006,27（4）:34-36.

[9]李艾黎,都立輝,霍貴成.保加利亞乳桿菌分批發(fā)酵工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2006,26（12）:57-59.

[10]韓瑨.植物乳桿菌ST-Ⅲ高密度培養(yǎng)的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2008,31（6）:273-275.

[11]李艾黎,杜鵬,霍貴成.酵母粉濃度對酸奶菌株發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的影響[J].食品工業(yè)科技,2009,30（4）:166-167,170.

[12]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn).GB 4789.2-2010食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[13]陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[14]蔡義民,熊井清雄,廖芷,等.乳酸菌劑對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善效果[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,28（2）:73-82.

[15]侯霞霞,來航線,韋小敏.青貯用乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,43（1）:183-192.

[16]聶明達(dá),薛艷林.乳酸菌對賴草青貯飼料品質(zhì)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014（8）:80-81.

[17]劉晗璐,桂榮,塔娜.乳酸菌青貯添加劑的研究與應(yīng)用[J].中國飼料,2006（23）:28-30.

[18]范娜,陳雪峰.兩種益生菌混合發(fā)酵乳清培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].商洛學(xué)院學(xué)報,2011,25（6）:50-55.

[19]Bury D,Geciova J,Jelen P.Effect of yeast extract supplementa?tion on beta-galactosidase activity of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 11842 grown in whey[J].Czech Journal of Food Sciences,2001,19（5）:166-170.