KLF14基因過表達對改善Hepa1-6小鼠肝癌細胞胰島素抵抗的作用

代繼桓 李 伶 楊剛毅 任 艷 賈彥軍 羅小河 冉文俠 曾 夢

(重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院 教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶 400016)

KLF14基因過表達對改善Hepa1-6小鼠肝癌細胞胰島素抵抗的作用

代繼桓 李 伶 楊剛毅1任 艷 賈彥軍 羅小河 冉文俠 曾 夢1

(重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院 教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶 400016)

目的 探討KLF14基因過表達對小鼠肝癌細胞Hepa1-6胰島素抵抗的影響。方法 實時熒光定量PCR(RT-QPCR)檢測KLF14基因mRNA在健康C57BL/6J小鼠各組織的表達分布情況；構建小鼠KLF14基因重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-KLF14并轉染Hepa1-6細胞，RT-PCR法檢測KLF14基因mRNA的表達；Western印跡檢測KLF14及p-AKT蛋白水平的表達。結果 成功構建pIRES2-EGFP-KLF14質粒；轉染肝癌細胞48 h后，KLF14 mRNA和蛋白水平明顯高于對照組和空載組(P<0.01)；轉錄水平上KLF14基因在小鼠體內普遍表達，其mRNA相對表達量由高到低依次為心臟、骨骼肌、肝臟、脂肪、小腸、腎臟、腦、肺、胃、脾、附睪；非轉染組給予血清干預后，正常人血清處理組和糖尿病病人血清處理組無明顯差異；而轉染組給予血清干預后，糖尿病病人血清處理組p-AKT表達量較正常人血清處理組明顯增加；在胰島素刺激情況下，無論轉染組或非轉染組，給予PI3K抑制劑LY294002后，p-AKT表達受抑。結論 KLF14在C57BL/6J小鼠多種組織均有表達，提示其可能在維持正常生理功能中發(fā)揮一定作用；KLF14基因過表達可促進AKT的活化，并且其增加胰島素敏感性的作用在糖尿病狀態(tài)下較正常人更為明顯。

KLF14；Hepa1-6細胞；基因表達；胰島素抵抗

胰島素抵抗(IR)是肥胖、2型糖尿病(T2DM)、高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化(AS)等疾病的共同病理生理基礎。Kruppel-like factor(KLF)14是一種在人體組織中廣泛表達的轉錄因子，在多個物種間具有高度保守性〔1〕。近年來，多項全基因組關聯性研究(GWAS)發(fā)現，KLF14、甘油三酯(TG)、膽固醇(TG)水平、肥胖與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關〔2，3〕。為了研究KLF14在IR中發(fā)揮的作用，本研究運用分子克隆技術，構建pIRES2-EGFP-KLF14真核過表達質粒，特異性提高KLF14基因的表達；通過免疫印跡檢測胰島素作用關鍵分子蛋白液酶B(AKT)的活化程度，進一步研究KLF14基因表達上調對肝細胞胰島素敏感性的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hepa1-6肝癌細胞株，購于中國協和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心；清潔級C57BL/6J雄性小鼠購于重慶醫(yī)科大學動物中心；DMEM高糖培養(yǎng)基購于GIBCO公司；胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；細胞轉染試劑Lipofectamine?2000、Opti-MEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；RNA提取試劑和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、引物、限制性內切酶等均為TAKARA公司產品；質粒小抽試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自OMEGA公司；質粒大抽試劑盒(去內毒素)購自北京天根生化科技公司；大腸桿菌DH5α甘油菌為本課題組保存；pIRES2-EGFP載體(5.3 kb)由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍感染病研究所陳耀凱惠贈；細胞蛋白提取試劑(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、 二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑及磷酸酰肌酶激酶(PI3K)抑制劑LY294002均購自碧云天公司；抗KLF14一抗購自美國Abcam公司，抗P-AKT及抗AKT抗體均購自美國CST公司，抗鼠β-actin一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗IgG二抗均購自北京中杉金橋公司。

1.2 pIRES2-EGFP-KLF14真核表達質粒的構建與鑒定 采用RT-PCR法擴增小鼠KLF14基因全編碼區(qū)cDNA片段，所用引物上游：5'-CCGGAATTCATGTCGGCCGCCGTGGCT-3'，下游：5' GCGGTCGACC TACAGGCAAGCAGTGAAGCT 3'，產物大小978 bp，EcoR I、Sal I雙酶切后插入pIRES2-EGFP表達載體，轉化DH5α感受態(tài)菌后挑單克隆質粒小抽，經雙酶切、測序鑒定。鑒定正確后用去內毒素的質粒大抽試劑盒抽提備用。

1.3 KLF14在正常小鼠各組織中表達分布情況 取清潔級C57BL/6J雄性小鼠，脫頸處死后取其多處組織如肝、心臟、腦、肺、脂肪、睪丸、胰、肌肉、腎臟，提取各組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，SYBER-Green I熒光染料實時熒光定量PCR檢測各組織KLF14表達情況。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉染 DMEM+10%FBS+雙抗(青鏈霉素)，5%CO2，37℃ 孵育Heap1-6細胞，待細胞長到80%～90%進行真核過表達質粒(pIRES2-EGFP-KLF14)轉染；轉染48 h后，將培養(yǎng)基換為DMEM+1%FBS+雙抗(青鏈霉素)饑餓培養(yǎng)16 h；按照分組，抑制劑組給予PI3K抑制劑(LY294002，10 μmol/L)處理1 h；然后，按分組分別給予1%正常血清(N)和1%糖尿病人血清(D)干預10 min；最后，按分組分別給予胰島素(INS，100 nmol/L)刺激5 min，收集細胞備用。

1.5 KLF14及p-AKT蛋白表達檢測 采用Western印跡法檢測各組細胞KLF14蛋白表達水平。提取細胞總蛋白，按每泳道加80或100 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉3 h，一抗(內參β-actin 1∶250，KLF14 1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，二抗(1∶2 500稀釋)孵育1 h并洗脫，將PVDF膜置于化學發(fā)光板，加入發(fā)光試劑，室溫反應2 min后置化學發(fā)光成像系統成像。

1.6 統計學方法 應用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 pIRES2-EGFP-KLF14真核表達質粒構建及鑒定結果 pIRES2-EGFP-KLF14質粒經EcoR I、Sal I雙酶切，得到約5.3 kb和978 bp大小的片段(圖1)，分別代表質粒pIRES2-EGFP和插入目的片段，與預期結果完全一致，說明KLF14基因已正確克隆到pIRES2-EGFP表達載體。且經測序，結果顯示插入序列即KLF-14基因CDS區(qū)(圖2)。

DL600和DL2000為DNA Marker；1,2,3,4均為pIRES2-EGFP-KLF14+EcoRⅠ+SalⅠ

圖2 重組質粒DNA測序結果圖

2.2 KLF14在正常小鼠各組織中表達情況 KLF14基因廣泛表達于機體各組織，相對高表達于心臟(1.000 0±0.091 1)、肌肉(0.713 7±0.065 8)、肝臟(0.245 2±0.050 6)，而相對低表達于脾臟(0.031 5±0.007 1)、附睪(0.024 2±0.006 4)；在脂肪、小腸、腎臟、腦、肺、胃中的表達分別為0.173 8±0.034 9、0.154 7±0.038 8、0.152 4±0.041 1、0.100 1±0.039 4、0.081 0±0.023 6、0.060 2±0.013 5。

2.3 pIRES2-EGFP-KLF14真核表達質粒對KLF14表達的影響 與對照組相比，在pIRES2-EGFP-KLF14質粒轉染Hepa1-6肝細胞組中，KLF14 mRNA及蛋白水平均顯著上調(P<0.01)，而空載組中KLF14 mRNA及蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4 KLF14表達上調對AKT 活性的影響 在非轉染KLF14組，胰島素刺激后，可見p-AKT有表達，給予正常人和糖尿病病人血清干預后，p-AKT表達量無明顯差異；在KLF14轉染組，胰島素刺激或非刺激情況下，均有p-AKT表達，給予正常人和糖尿病病人血清干預后，可見病人組p-AKT表達較正常組明顯增加；在胰島素刺激情況下，無論轉染組或非轉染組，給予PI3K抑制劑LY294002后，p-AKT表達受抑制。見圖3。

表1 體外構建KLF14過表達細胞模型mRNA和蛋白相對表達量的比較±s，n=3)

與空白組比較：1)P<0.01；與空載組比較：2)P<0.01

“—”表示未處理，“+”表示處理，N：正常人血清干預；D：糖尿病人血清干預；INS胰島素刺激；LY：PI3K抑制劑LY294002

3 討 論

KLF14又名BTEB5，編碼序列在多個物種間具有高度保守性。研究顯示，人KLF14基因定位于7q32.3，全長約1 059 bp，是KLF家族成員中唯一一個不含內含子的基因。進一步研究發(fā)現，KLF14與KLF16具有高度同源性，可能是KLF16進化過程中的一個反轉錄副本〔3〕。KLF14蛋白屬于SP1/XKLF轉錄因子家族，C端具有一個高度保守的DNA結合域，N端含有一個轉錄調節(jié)域，且C端結合區(qū)含有三個連續(xù)的C2H2鋅指模體，能特異性識別和結合靶基因啟動子區(qū)域的GC盒、CACCC盒等核心元件，直接作用于DNA，調節(jié)靶基因的轉錄〔4〕。KLF家族成員的N端轉錄調節(jié)域是多變的，該結構域富含谷氨酰胺、脯氨酸等，可以和輔助激活因子和(或)輔助抑制因子相互作用，從而激活和(或)抑制特定啟動子的活性，參與調控下游基因的表達。越來越多的GWAS研究顯示，KLF14作為T2DM易感性基因，與T2DM、肥胖及高脂血癥等代謝綜合征有著緊密的聯系〔5〕。然而，關于KLF14基因與T2DM的具體作用分子機制上尚不明確。

KLF14基因在人體的多個組織普遍表達，在胚胎和胚外組織作為母源基因的印記表達。然而，KLF14在各組織中的相對表達豐度至今未見報道。本實驗檢測顯示，KLF14基因在小鼠多個組織均有不同程度的表達。眾所周知，肝臟和脂肪是參與機體物質和能量代謝的重要器官和組織，同時也是糖尿病和IR發(fā)生的具有代表性的靶組織。本研究結果顯示KLF14 mRNA在肝臟和脂肪高度表達，進一步驗證了其與T2DM和肥胖的風險相關性，同時推測KLF14可能參與肝臟和脂肪內的某些代謝活動，從而影響T2DM和IR的發(fā)生發(fā)展。

INS受體(InsR)/IRS/AKT是胰島素作用的經典通路，當INS與InsR結合后，可以激活InsRβ亞單位的酪氨酸激酶活性，相繼發(fā)生InsR底物酪氨酸磷酸化和AKT絲/蘇氨酸磷酸化，進而通過促進能糖原合成、葡萄糖轉運等糖代謝通路，提高INS敏感性。而InsR、IRS的酪氨酸激活性降低和/或AKT絲/蘇氨酸激酶活性下降，能夠明顯抑制INS發(fā)揮作用，進而導致IR的發(fā)生〔2,6,7〕。本研究結果顯示，INS單一刺激后， p-AKT活性明顯升高；在給予健康人和糖尿病人血清干預后，p-AKT活性無顯著性變化；然而， KLF14表達上調能夠顯著提升p-AKT活性由此，可以看出KLF14能夠增加IRS敏感性?？赡苁峭ㄟ^直接調控INS作用通路，或者間接促進機體內其他INS增敏因子的產生引起INS敏感性發(fā)生變化，然而，具體機制有待于進一步深入研究。其次，本研究結果顯示，在給予正常和糖尿病病人血清干預后，病人血清處理組p-AKT活性較健康人血清干預組明顯增加，提示KLF14可能作為疾病狀態(tài)下的代償機制，拮抗糖尿病人體內IR的進展。由此說明，KLF14作為機體新的INS作用通路調控因子，在INS作用通路中發(fā)揮著關鍵的作用，進一步了解其具體分子機制，必會為糖尿病的治療帶來新的手段。

1 Comai L.Human genetics:human genetics discovering ourselves〔J〕.Heredity,2007;99(5):481-2.

2 Voight BF,Scott LJ,Steinthorsdottir V,etal.Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis〔J〕.Nat Genet,2010;42(7):579-89.

3 Chasman DI,Paré G,Mora S,etal.Forty-three loci associated with plasma lipoprotein size,concentration,and cholesterol content in genome-wide analysis〔J〕.PLoS Genet,2009;5(11):e1000730

4 Truty MJ,Lomberk G,Fernandez-Zapico ME,etal.Silencing of the transforming growth factor-beta(TGFbeta)receptor II by Kruppel-like factor 14 underscores the importance of a negative feedback mechanism in TGFbeta signaling〔J〕.J Biol Chem,2009;284(10):6291-300.

5 Small KS,Hedman AK,Grundberg E,etal.Identification of an imprinted master trans regulator at the KLF14 locus related to multiple metabolic phenotypes〔J〕.Nat Genet,2011;43(6):561-4.

6 Chen G,Bentley A,Adeyemo A,etal.Genome-wide association study identifies novel loci association with fasting insulin and insulin resistance in African Americans〔J〕.Hum Mol Genet,2012;21(20):4530-6.

7 Nielsen T,Sparso C,Grarup N,etal.Type 2 diabetes risk allele near CENTD2 is associated with decreased glucose-stimulated insulin release〔J〕.Diabetologia,2011;54(5):1052-6.

〔2014-03-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of KLF14 gene overexpression on insulin resistance in hepa1-6 hepatoma carcinoma cell

DAI Ji-Huan,LI Ling,YANG Gang-Yi,etal.

Medical Diagnostics in the Ministry of Education,Department of Endocrinology,the Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Objective To investigate the role of KLF14 overexpression on insulin resistance in Hepa1-6 cell.Methods The tissue distribution of KLF14 in healthy C57/6J mice was detected by real-time quantitative PCR(RT-PCR). Expression vector for pIRES2-EGFP-KLF14 gene was constructed and transfected into Hepa1-6 cell. The mRNA level of KLF14 was determined by RT-QPCR;KLF14 and p-AKT protein levels were measured by Western blot.Results The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-KLF14 was constructed successfully. In transfected hepa1-6 cell,KLF14 mRNA and protein were significantly higher than those of control and blank cells after 48 h(P<0.01).The KLF14 gene was ubiquitously in mice. The relative mRNA expression level of KLF14 from high to low in order was heart,muscle,liver,fat,intestine,kidney,brain,lung,stomach,speech and epididymis. After treated with serum intervention,there was no significant difference between normal and patient groups without transfection;whereas the p-AKT expression in the patient group with transfection was significantly increased compared with that in normal group. In insulin-stimulated conditions,the p-AKT expression was inhibited after treated with PI3K inhibitor LY294002 regardless of transfection or not.Conclusions There is an extensive expression of KLF14 in various tissues of C57BL/6J mice,indicating that KLF14 might play a role in maintaining normal physiological function;KLF14 gene overexpression could promote the activation of AKT,and its effects in increasing insulin sensitivity in diabetics is more distinct than normal people.

KLF14；Hepa1-6 cell；Gene expression；Insulin resistance

國家自然科學基金資助項目(81270913，81070640，81100567,81300702，81300670)；教育部博士點基金資助項目(20125503110003)；重慶市自然科學基金重點項目資助(cstc2012 jjB10022)

李 伶(1962-)，女，教授，博士生導師，主要從事胰島素抵抗，糖、脂代謝的研究。

代繼桓(1990-)，男，在讀碩士，主要從事胰島素抵抗，糖、脂代謝的研究。

R34

A

1005-9202(2015)12-3237-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.022

1 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內分泌科