骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌大鼠血管生成和細(xì)胞增殖的影響

胡方方 周家華 鄭國燦 程張軍 楊 揚(yáng)

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肝膽外科，江蘇 南京 210009)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌大鼠血管生成和細(xì)胞增殖的影響

胡方方 周家華 鄭國燦 程張軍 楊 揚(yáng)

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肝膽外科，江蘇 南京 210009)

目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)對肝癌大鼠血管生成和細(xì)胞增殖的影響。方法 分離得到Wistar大鼠BMSC。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定后進(jìn)行體外增殖培養(yǎng)，制作大鼠BMSC培養(yǎng)基(BMSC-CM)。結(jié)果 MTT測定顯示，25%、50%、75%及100%BMSC-CM組的吸光度(A值)均明顯高于0 BMSC-CM組，且隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀測定顯示，25%、50%、75%及100%BMSC-CM組的細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)均明顯高于0 BMSC-CM組，且隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。ELISA測定顯示，對于甲胎蛋白(AFP)的分泌情況，25%、50%、75%及100%BMSC-CM組均明顯高于0 BMSC-CM組，且隨著吸光度(A值)的增加而升高(P<0.05)。SABC法測定顯示，BMSC組血管內(nèi)皮因子(VEGF)表達(dá)明顯高于單純造模組(P<0.05)。結(jié)論 BMSC能夠明顯促進(jìn)肝癌大鼠血管生成與細(xì)胞增殖。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝癌；血管生成；增殖

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一種具有高增殖活性和多向分化潛能的未分化細(xì)胞〔1〕。有研究證實(shí)，BMSC經(jīng)過內(nèi)皮生長因子的誘導(dǎo)，可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞〔2〕。肝癌的發(fā)生與發(fā)展與BMSC也有著十分密切的聯(lián)系〔3〕。本文旨在探討B(tài)MSC對肝癌大鼠血管生成和細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 40只Wistar大鼠〔南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(蘇)2002-0032〕，體質(zhì)量60～80 g，平均(69.23±8.02)g。大鼠飲水及飼料均經(jīng)過高壓滅菌(121℃、30 min)，動物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》等法規(guī)的要求。選取CBRH-7919肝癌細(xì)胞系(南京市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠淋巴細(xì)胞分離液(上海朗頓生物科技有限公司)，Gibco胎牛血清(FBS，上海玉博生物科技有限公司)，DMEM/F-12培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(上海研拓生物科技有限公司)，大鼠甲胎蛋白(AFP)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海盈公生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)，碘化丙啶染液。制備BMSC培養(yǎng)基：向DMEM/F-12培養(yǎng)基中混入10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素。

1.3 BMSC的分離培養(yǎng) 采取貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSC，具體措施如下〔4〕：①采取頸椎脫臼法處死10只大鼠，置于75%乙醇中15 min消毒。②在無菌環(huán)境下摘除大鼠腓骨與脛骨，注射器抽取L-DMEM多次沖洗骨髓腔直至腓骨與脛骨發(fā)白，沖出骨髓腔內(nèi)細(xì)胞后加以分散制成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液緩慢加入含有大鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中后，2 000 r/min，離心20 min。③抽取試管中段單個核細(xì)胞層，用L-DMEM沖洗2次，除去殘留血清，1 000 r/min，離心5 min后，棄上清液。④將試管液混入含10%的FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，接種于70 cm2培養(yǎng)瓶中，5～6 d后換液，保留貼壁細(xì)胞。此后每4～5 d換液1次，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。⑤觀察存在≥80%的細(xì)胞發(fā)生融合后，給予0.25%的胰蛋白酶消化，依照5×104ml-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 BMSC的檢測 用胰蛋白酶消化P3代BMSC，充分吹打完全后制得含1×105ml-1細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，先后加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC及CD34-PE流式抗體。避光、37℃條件下孵育30 min后用1%的多聚甲醛固定，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行BMSC的檢測。

1.5 BMSC-CM的制備 BMSC傳代培養(yǎng)至第3代，當(dāng)70%～80%的細(xì)胞發(fā)生融合時，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)目約為3×106個，將培養(yǎng)瓶充分沖洗后，混入15 ml含有10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，待24 h后用3 kD的超濾管濃縮該培養(yǎng)基25倍，即制備成BMSC的條件培養(yǎng)基(BMSC-CM)，規(guī)定此培養(yǎng)基為100%BMSC-CM。

1.6 MTT比色法測定肝癌細(xì)胞的增殖情況 用胰蛋白酶消化生長良好的P3代的7919肝癌細(xì)胞，混入15 ml含有10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基得到重懸細(xì)胞，按照6×104/孔接種于96孔板內(nèi)，每孔混入100 μl，培養(yǎng)12 h后，棄掉培養(yǎng)液，混入含25%、50%、75%及100%BMSC-CM及含5%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液。將0 BMSC-CM設(shè)為對照組，其余4組作為觀察組，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔混入10 μl MTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h后，棄掉上清液，每孔混入150 μl二甲亞砜，10 min低速震蕩后，采用酶標(biāo)儀測定A492 nm值。

1.7 流式細(xì)胞儀測定肝癌細(xì)胞的周期情況 用胰蛋白酶消化生長良好的P3代的7919肝癌細(xì)胞，混入15 ml含有10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基得到重懸細(xì)胞，按照1.4×105ml-1的方式接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后，棄掉培養(yǎng)液，混入含25%、50%、75%及100%BMSC-CM及含5%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用胰蛋白酶對培養(yǎng)液進(jìn)行消化，離心后PBS沖洗2次，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個后采用-20℃預(yù)冷的75%乙醇固定于-4℃的環(huán)境中，48 h后取出，PBS沖洗1次，混入碘化丙啶染液(500 μl/106個細(xì)胞)，避光、4℃條件下孵育30 min后，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(PI)。

1.8 ELISA測AFP的分泌情況 用胰蛋白酶消化生長良好的P3代的7919肝癌細(xì)胞，混入15 ml含有10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基得到重懸細(xì)胞，按照6×104/孔的方式接種于12孔板內(nèi)，直至細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長時，棄掉培養(yǎng)液，混入含25%、50%、75%及100%BMSC-CM的無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，采集上清液檢測AFP分泌情況。

1.9 SABC法測定微血管密度及VEGF的表達(dá)情況 將未處死的30只大鼠隨機(jī)分為BMSC移植組、單純造模組、空白對照組。①BMSC組：于第4、8、12周時經(jīng)尾靜脈注入1×106個P3代BMSC；②單純造模組：于第4、8、12周時經(jīng)尾靜脈注入等量生理鹽水；③空白對照組不予干預(yù)。造模21 w后采用頸椎脫臼法處死，取出肝臟組織，采用蘇木精-伊紅染色，觀察肝臟形態(tài)特點(diǎn)，并采用免疫組化SABC法測定微血管密度及VEGF的表達(dá)情況。微血管密度陽性以血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為準(zhǔn)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)〔5〕。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC的形態(tài)學(xué)變化 BMSC提取接種后，培養(yǎng)3 d后于顯微鏡下可觀察到貼壁細(xì)胞生長；培養(yǎng)7 d后可見細(xì)胞呈集落式生長；培養(yǎng)15 d后于顯微鏡下可觀察到梭形細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，胞外有較長突起結(jié)構(gòu)，折光性良好；培養(yǎng)45 d后細(xì)胞增殖速度明顯增快，發(fā)生首次傳代后，大約每7 d再次傳代，培養(yǎng)至P3代時，可見呈漩渦樣生長的單一細(xì)胞集落。

2.2 不同濃度BMSC-CM對肝癌細(xì)胞增殖情況的影響 25%、50%、75%及100%BMSC-CM組的吸光度(A值)及增殖率均明顯高于0 BMSC-CM組，且隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度BMSC-CM對肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響±s)

與0 BMSC-CM組相比：1)P<0.05；與25% BMSC-CM比較：2)P<0.05;與50%BMSC-CM組比較：3)P<0.05；與75%BMSC-CM比較：4)P<0.05

2.3 不同濃度BMSC-CM對肝癌細(xì)胞周期情況的影響 流式細(xì)胞儀測定顯示，25%、50%、75%及100%BMSC-CM組的細(xì)胞增殖指數(shù)(18%、21%、24%、27%)均明顯高于0 BMSC-CM組(16%)，且隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。

2.4 不同濃度BMSC-CM對肝癌細(xì)胞AFP的分泌情況的影響 AFP的分泌情況，25%、50%、75%及100%BMSC-CM組(1.90、2.67、3.01、3.59)均明顯高于0 BMSC-CM組(0.19)，且隨著吸光度(A值)的增加而升高(P<0.05)。

2.5 肝臟癌變過程中的病理變化 BMSC組：鏡下可見肝細(xì)胞廣泛脂肪變、壞死，肝小葉纖維支架塌陷，門管區(qū)-肝小葉中央靜脈延伸擴(kuò)展形成纖維隔，形成假小葉，可見大量再生結(jié)節(jié)，癌細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核顯著增大且深染；單純造模組：鏡下可見少量肝細(xì)胞脂肪變、壞死，癌細(xì)胞異型性不明顯；空白對照組：鏡下可見肝細(xì)胞膜完整，核大而圓，門管區(qū)內(nèi)肝細(xì)胞排列整齊。見圖1。

2.6 微血管密度及VEGF的表達(dá)情況 免疫組化SABC法測定顯示，BMSC組與單純造模組均可觀察到VEGF陽性表達(dá)，且BMSC組VGEF表達(dá)明顯高于單純造模組；空白對照組可觀察到少量VGEF的陽性表達(dá)；BMSC組VGEF陽性表達(dá)明顯多于單純造模組，而單純造模組微血管密度則顯著高于空白對照組，見圖2、圖3。

圖1 兩組肝細(xì)胞病理變化(×400)

圖2 兩組VEGF測定(×400)

圖3 兩組微血管密度染色結(jié)果(×400)

2.7 VEGF與微血管密度表達(dá)的相關(guān)性分析 微血管密度與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.721，P=0.003)。

3 討 論

BMSC是一種能夠從多種動物及人體的許多部位和組織中(包括骨髓、骨膜、脂肪組織等)提取的多能干細(xì)胞，其中骨髓組織中的BMSC含量最為豐富〔6〕。研究表明，BMSC可在不同環(huán)境和細(xì)胞因子的影響下，定向分化為成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等〔7〕。BMSC還具有促進(jìn)血管再生、改善組織供血的功能，BMSC促血管再生的機(jī)制為BMSC旁分泌的VGEF具有促進(jìn)其向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能〔8〕。目前關(guān)于BMSC對肝癌的影響作用仍存在較大分歧，有報(bào)道證實(shí)，BMSC是肝癌壞死區(qū)肝細(xì)胞的主要細(xì)胞來源，促進(jìn)了肝癌的發(fā)生與發(fā)展〔9〕。但也有研究指出，BMSC具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用〔10〕。

本研究結(jié)果顯示，BMSC其旁分泌物質(zhì)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，且濃度越高，促增殖能力越強(qiáng)。這與李天然等〔11〕的研究結(jié)果一致，即BMSC能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，上調(diào)肝癌細(xì)胞的增殖能力。此外，BMSC還促進(jìn)了肝癌細(xì)胞AFP的分泌，且隨BMSC濃度的增加而增加。AFP是肝癌的特異性標(biāo)志物，隨著病情惡化AFP的含量會急劇增加，這也反映出BMSC促進(jìn)了肝癌的進(jìn)展。本次研究結(jié)果還顯示，BMSC可使VGEF的陽性表達(dá)及微血管密度顯著增加。有研究表明，VGEF是一種具有強(qiáng)大促血管生成功能的生長因子〔12〕。說明BMSC能夠促進(jìn)肝癌大鼠血管的生成。宋浩等〔13〕的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。綜上，BMSC能夠明顯促進(jìn)肝癌大鼠血管生成與細(xì)胞增殖，但其具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

1 郭 輝，張于娟，魏曉光，等.低氧環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)〔J〕.中國組織工程研究，2014；18(23)：3627-32.

2 束 波，范 芳.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠血管成形術(shù)后內(nèi)膜增生及炎癥因子表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(14)：2989-92.

3 袁 博，陳昆侖，張 嵐，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對RH-35肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014；35(4)：455-9.

4 王翠艷，魏芳晶，陰淑瑩，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(5)：1086-8.

5 王東旭，姜海行，蘇思標(biāo)，等.體外共培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞增殖的影響：Cyclin D1與P27表達(dá)調(diào)控〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù) 2010；14(10)：1764-8.

6 辛 毅，李 娜，黃益民，等.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014；31(1)：8-14.

7 康少平，姜文靜，李 萍.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化和臨床應(yīng)用〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011；15(49)：9279-82.

8 劉軍朋，姜文學(xué).骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌促血管生成的研究進(jìn)展〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011；17(1)：130-4.

9 周 軍，李天然，宋 斌.hMSC對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌模型影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.功能與分子醫(yī)學(xué)影像學(xué)(電子版)，2013；2(2)：102-6.

10 王 強(qiáng)，鞏 鵬，金 實(shí)，等.磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞作用的研究〔J〕.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015；37(1)：13-6.

11 李天然，盧光明，宋 斌.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2014；23(9)：1056-60.

12 田 甜，賈赤宇.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織損傷修復(fù)中的研究現(xiàn)狀〔J〕.中華損傷與修復(fù)雜志，2012；7(4)：418-21.

13 宋 浩，紀(jì)衛(wèi)政，邰沁文.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌模型大鼠血管形成的影響〔J〕.中國組織工程研究，2012；16(14)：2481-6.

〔2013-11-21修回〕

(編輯 苑云杰)

胡方方(1982-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事肝膽胰疾病研究。

R735.7

A

1005-9202(2015)12-3226-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.017