桃核承氣湯對重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥因子的調(diào)控作用及機制

鐘 健 劉 麗 劉大晟 徐云生 吳先林

(暨南大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

桃核承氣湯對重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥因子的調(diào)控作用及機制

鐘 健 劉 麗1劉大晟2徐云生3吳先林4

(暨南大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

目的 探討重癥急性胰腺炎(SAP)模型大鼠不同時間點炎性因子的變化情況及桃核承氣湯對其影響和作用機制。方法 將90只SD大鼠隨機分為空白對照組、SAP模型組、桃核承氣湯組、奧曲肽組、桃核承氣湯+奧曲肽組。除空白對照組外，其余各組采用20% L-精氨酸腹腔注射制備大鼠SAP模型，每組于12、24、48 h三個時間點各處死6只大鼠，采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-10表達水平，生化分析儀檢測血清淀粉酶(AMY)、Ca2+水平，采用HE染色觀察胰腺病理變化。結果 與空白對照組相比，SAP模型組各時間點大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平均顯著升高(P<0.05)；三個治療組與SAP模型組各檢測標本組間比較有統(tǒng)計學差異，且胰腺出血壞死及炎癥細胞浸潤明顯減輕(P<0.05)；桃核承氣湯、奧曲肽對減輕SAP大鼠炎癥因子及胰腺病理變化的主效應有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩藥合用不存在交互作用(P>0.05)。結論 桃核承氣湯能明顯減少SAP大鼠TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，提高IL-10水平，從而減輕炎癥反應并對胰腺及機體起到保護作用，抑制SAP病情的發(fā)展。

重癥急性胰腺炎；桃核承氣湯；炎癥因子；L-精氨酸

重癥急性胰腺炎(SAP)以胰腺出血壞死多見，常繼發(fā)感染、腹膜炎和休克等多種并發(fā)癥，病死率高達30%～40%〔1〕。若炎癥介質(zhì)級聯(lián)效應失控，可使炎癥效應放大，迅速導致全身炎性反應綜合征(SIRS)，并可進一步發(fā)展為多器官衰竭綜合征(MODS)。比較重要的促炎癥因子有腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6及抗炎癥因子IL-10。SAP中醫(yī)辨證為氣血同病，瘀熱互結，因此治療上可予桃核承氣湯通腑瀉熱、活血化瘀。為探討桃核承氣湯對SAP的作用機制，本實驗擬檢測不同處理方式、不同時段TNF-α、IL-10、IL-6水平，從而為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 將L-精氨酸(sigma公司)90 g溶于450 ml生理鹽水中，攪拌加熱至30℃，調(diào)pH至7.0，配成20%的L-精氨酸溶液；桃核承氣湯生藥材購自廣東和翔制藥公司，將桃仁24 g，生大黃24 g，桂枝12 g，芒硝12 g，甘草12 g進行煎煮，大黃后下，芒硝溶解，水煎配成200 ml含有42 g生藥材的桃核承氣湯；將奧曲肽注射液100 μg(Novartis Pharma AG公司)溶于0.9%生理鹽水中，配置成4 μg/ml的奧曲肽注射液。以上試劑均4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物分組 SD雄性大鼠90只，SPF級，體重180～220 g，購于廣東省動物實驗中心，遵循12 h光照/12 h黑暗周期飼養(yǎng)于暨南大學實驗動物管理中心，自由進食和飲水。適應環(huán)境1 w后，將大鼠隨機分為空白對照組、SAP模型組、桃核承氣湯組、奧曲肽組、桃核承氣湯+奧曲肽組，每組18只。

1.3 實驗動物處理 采用20% L-精氨酸按0.25 g/100 g體重腹腔注射2次，間隔1 h，除空白對照組外，其余各組大鼠進行SAP模型制備，空白對照組大鼠予以0.9%生理鹽水按相同的方法腹腔注射。模型制備后即刻、6、12、24、30、36 h，空白對照組、SAP模型組大鼠僅予以觀察處理；桃核承氣湯組大鼠予以濃度為21%的桃核承氣湯按每天2.35 ml/100 g灌胃，給藥劑量參照郝光榮〔2〕主編的《實驗動物學》中常用實驗動物及人的體表面積比例進行換算得出；奧曲肽組大鼠予以奧曲肽注射液按體重1 μg/100 g背部皮下注射；桃核承氣湯+奧曲肽組大鼠予以濃度為21%的桃核承氣湯按每天2.35 ml/100 g灌胃及奧曲肽按體重1 μg/100 g背部皮下注射。

1.4 實驗標本采集與檢測 各組實驗動物予以相應處理后，于第12、24、48小時，每組隨機取大鼠6只，采用異氟烷吸入麻醉，麻醉后開腹從心臟取血(量約6 ml)制備血清，采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-10，于酶標儀上讀取樣品各孔的OD值，由標準曲線算出其濃度，同時對血清淀粉酶(AMY)、血清鈣離子(Ca2+)進行測定。取胰腺組織(0.6 cm×0.6 cm)浸于4%的多聚甲醛溶液中做常規(guī)石蠟切片、HE染色，并采用改良Kusske評分標準對胰腺組織進行病理評分。

2 結 果

2.1 各組化驗指標測定結果及胰腺病理評分比較 SAP模型組與空白對照組比較，大鼠各時間點血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、水平及胰腺病理評分明顯升高，Ca2+水平明顯降低(P<0.05)，且L-精氨酸對大鼠實驗標本測定結果的影響與時間有關(P<0.05)。三個治療組各時間點大鼠血清TNF-α、IL-6、AMY水平較SAP模型組明顯降低，IL-10、Ca2+水平及胰腺病理評分較之明顯升高(P<0.05)。桃核承氣湯、奧曲肽對除AMY外的指標不存在交互作用(P>0.05)，但兩藥合用明顯有相加作用。給藥時間對大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、Ca2+及胰腺病理評分測定結果的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但時間、桃核承氣湯、奧曲肽三因素之間不存在交互作用(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、Ca2+水平及胰腺病理評分測定結果

2.2 胰腺病理形態(tài)學結果 空白對照組結構完整，無細胞水腫，胰管走行正常，未見小葉間間隙增寬，無出血壞死，偶見炎癥細胞。SAP模型組胰腺結構彌漫性破壞，細胞腫脹，彌漫性小葉間水腫，實質(zhì)出血明顯，片狀壞死細胞，大量炎癥細胞浸潤，隨時間增長而進行性加重。桃核承氣湯、奧曲肽組胰腺結構欠清，間質(zhì)水腫減輕，腺泡壞死減少，炎癥細胞浸潤較SAP組減少。桃核承氣湯+奧曲肽組胰腺結構欠清，彌漫性小葉間水腫，出血壞死灶及炎癥細胞較單獨用藥組減輕。三個治療組胰腺組織病理學顯示24 h組最重，48 h組有所減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理改變(HE，×200)

3 討 論

SAP無論病因如何，最終結果總是胰腺出血壞死和全身炎性反應，與炎性因子的過度生成有關。多種炎性因子發(fā)生瀑布樣級聯(lián)反應，引起SAP炎癥擴散，導致SIRS、MODS，甚至死亡。與SAP 發(fā)生有關的炎性因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子等，抗炎性細胞因子包括TGF-B和IL-10等〔3〕，它們之間相互關聯(lián)，相互影響。TNF-α是機體應激反應產(chǎn)生最早和最核心的炎癥介質(zhì)，具有早期迅速合成釋放的特點〔4〕，它在促進炎癥反應和誘導細胞凋亡方面具有重要的作用，其主要機制為誘導機體產(chǎn)生大量炎癥因子，反過來又可導致其自身水平升高，形成“瀑布樣”炎癥反應，導致局部微循環(huán)障礙，進一步加重胰腺的損傷。因此，TNF-α既為原始促炎遞質(zhì)，又是繼發(fā)性炎性因子的趨化因子〔5〕。IL-6是應激反應中重要的細胞因子，并受TNF-α的調(diào)控。IL-6在急性胰腺炎發(fā)病1 h后即可升高，比C反應蛋白升高早24～36 h，特別在SAP早期階段發(fā)揮重要作用〔6〕。IL-10是一種重要的炎癥負反饋調(diào)節(jié)細胞因子，具有很強的抗炎作用，能抑制TNF-α、IL-6等炎性細胞因子的合成，抑制炎性細胞在胰腺聚集，體內(nèi)IL-10低下提示免疫系統(tǒng)功能降低，是對SAP預后有重要價值的早期預測指標。SAP時促炎因子TNF-α、IL-6升高，而抗炎因子IL-10顯著下降，導致體內(nèi)抗炎因子與促炎因子的失衡，與SAP 的嚴重程度密切相關。中醫(yī)文獻中雖無細胞炎癥因子一說，但在SAP病因病機演變過程中產(chǎn)生濕、熱、痰、瘀等各種病理產(chǎn)物，其相互作用導致SAP病情發(fā)展迅速，逐漸加重，與炎性因子作用類似。SAP在其發(fā)病過程中，胰腺內(nèi)的胰脂肪酶從胰腺腺泡中溢出，水解生成脂肪酸，脂肪酸與血液中Ca2+結合形成不溶性的脂肪酸鈣，導致Ca2+水平下降，因此Ca2+水平是SAP病情嚴重程度評價的重要指標。

對SAP的治療，西藥主要是抑制胰酶分泌、減輕胰腺組織自身消化、抑制炎癥反應等，中醫(yī)則多采用通腑泄熱法，如何將中西醫(yī)結合的治療作用發(fā)揮最大化，一直是臨床和實驗研究的重點和方向?！堆C論·瘀血》認為：“世謂血塊為瘀，清血非瘀；黑色為瘀，鮮血非瘀，此論不確。蓋血初離經(jīng)，清血也，鮮血也，然即是離經(jīng)之血，雖清血鮮血，亦是瘀血”。本實驗認為SAP的治療應活血化瘀與通腑泄熱并舉，化瘀宜早不宜遲，化瘀愈早，效果愈佳。程夢琳等〔7〕發(fā)現(xiàn)預先給予桃核承氣湯可通過減輕炎癥反應對大鼠腸缺血再灌注損傷有保護作用。因此，本實驗在大鼠SAP模型制備完成后，立即給予桃核承氣湯、奧曲肽單獨治療及桃核承氣湯和奧曲肽聯(lián)合用藥治療。

奧曲肽是人工合成的八肽環(huán)狀化合物，可抑制胰酶分泌，減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生，改善胰腺微循環(huán)，作用較天然生長抑素持久，已在臨床中廣為施用。桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》，該方由桃仁、大黃、芒硝、桂枝、炙甘草組成，張仲景論桃核承氣湯主治病證，既論病變部位 “熱結膀胱”，又論病證在心而為發(fā)狂，旨在闡明運用桃核承氣湯的核心不在于辨病變部位，而是突出審明病變證機，亦即運用桃核承氣湯無論其病變部位在下焦還是在上焦，只要審明病變證機是“瘀熱”，即可以法用之〔8〕。同時，蘭萬成等〔9〕通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯可顯著降低膿毒癥患者血清IL-6、TNF-α，抑制炎癥反應。劉云濤等〔10〕研究表明，桃核承氣湯可明顯減輕膿毒癥大鼠小腸組織炎性損傷，其機制可能通過作用于TLR 信號通路，減少TLR4 mRNA 和CD4 mRNA 表達，進而下調(diào)TNF-α、IL-6 等炎癥因子有關。

如今，桃核承氣湯也被應用于如SAP、膿毒血癥感染導致的器官功能障礙等急重癥的治療。其中，桃仁活血通便、化瘀生新，大黃通腑瀉熱、逐瘀通經(jīng)，二者共為君藥。桂枝通經(jīng)活血，又可防寒藥遏邪凝瘀之弊，芒硝咸寒軟堅，助大黃攻逐瘀熱，同為臣藥，炙甘草益氣和中，緩諸藥峻烈之性，以防逐瘀傷正，為使藥，五藥相輔相成，共行通腑瀉熱、活血化瘀之功，有效地改善胰腺微循環(huán)。現(xiàn)代研究表明桃仁具有抑制血液凝固，穩(wěn)定血液流變，抗血栓的作用，其提取物具有抗炎和促進炎癥吸收的作用；大黃、芒硝具有抗感染作用，可對腸道細菌移位及內(nèi)毒素定植起到防御作用，并維持腸道菌群平衡，抑制胰液分泌，王林等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)大黃的主要成分大黃素可明顯降低大鼠TNF-α、IL-8 水平，有效減輕胰腺損害；桂枝不僅可以抑制血小板聚集、抗凝血，桂枝揮發(fā)油對急慢性和免疫損傷性炎癥均有顯著拮抗作用，其作用與影響炎癥介質(zhì)生成有關〔12〕；甘草對體內(nèi)代謝產(chǎn)物中毒及細菌毒素均有一定的解毒作用。因此，桃核承氣湯可通過活血化瘀、通腑瀉熱改善胰腺微循環(huán)，降低血管通透性，減輕內(nèi)毒素所致的損傷和破壞，對炎癥反應起到良好的抑制作用，進而減輕組織損害及炎癥侵入，有效抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的過度分泌，上調(diào)抗炎介質(zhì)IL-10的產(chǎn)生。本實驗結果說明桃核承氣湯、奧曲肽可有效抑制SAP病情的進展，并且桃核承氣湯和奧曲肽聯(lián)合用藥明顯優(yōu)于單獨用藥。

綜上所述，桃核承氣湯對SAP大鼠具有良好的保護作用，其機制可能是通過改善胰腺微循環(huán)，降低胰腺壞死程度，減輕SAP大鼠組織炎性損傷，進而下調(diào)促炎性因子TNF-α、IL-6水平，升高抗炎性細胞因子IL-10水平，在重建促炎和抗炎細胞因子中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，從而減輕胰腺壞死程度，阻止SAP進一步惡化。

1 張苗苗，張淑文，齊文杰.急性胰腺炎發(fā)病機制及中西醫(yī)治療研究進展〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2010；19(9)：1573-5.

2 郝光榮.實驗動物學〔M〕.第2版.上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2005：276.

3 Kazbay K，Tarnasky PR，Hawes RH，etal.Increased transforming grow th factor beta in pure pancreatic juice in pancreatitis〔J〕.Pancreas，2001；22(2)：193-5.

4 盛志勇，姚詠明.加強對膿毒癥免疫功能障礙及其檢測的研究〔J〕.解放軍醫(yī)學雜志，2011；36(1)：8.

5 Gunjaca I，Zunic J，Gunjaca M，etal. Circulating cytokine levels in acute pancreatitis-model of SIRS /CARS can help in the clinical assessment of disease severity 〔J〕.Inflammation，2012；35(2)：758-63.

6 蘆 波，錢家鳴.重癥急性胰腺炎病因及發(fā)病機制研究進展〔J〕.中國實用外科雜志，2012；(7)：590-2.

7 程夢琳，邱明義，陶春暉，等.桃核承氣湯對大鼠腸缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2006；25(10)：689.

8 王 付.桃核承氣湯的理論探索與實踐〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012；18(3)：211.

9 蘭萬成，李際強，石麗飛.桃核承氣湯對膿毒癥患者血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2013；(4)：356.

10 劉云濤，王大偉，楊榮源，等.通腑活血法對膿毒癥大鼠小腸組織的保護作用及機制研究〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2013；19(6)：645-8.

11 王 林，余亮科，王 原，等.大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的分子保護機制〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(11)：2319-20.

12 Research Group of Pain and Neuroscience in Vision 200 Project，East-West Medical Research Institute，Kyung Hee.The anti-inflammatory effect of Cinnamomi Ramulus〔J〕.J Korean Oriental Med，2005；26(2)：140-51.

〔2013-10-17修回〕

(編輯 徐 杰)

Mechanism of Taohechengqi decoction on inflammatory factors in severe acute pancreatitis rat model

ZHONG Jian， LIU Li， LIU Da-Sheng，etal.

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Objective To explore inflammatory factor changes on SAP rat in different time points and the effects，mechanism of Taohechengqi decoction.Methods 90 SPF SD male rats were randomly divided into blank control,SAP model,Taohechengqi decoction treated,octreotide treated,Taohechengqi decoction and octreotide combination treated groups. At the time of 12,24,48 h,each group was executed 6 rats. The serum TNF-α,IL-6,IL-10 levels were obtained by ELISA,the contents of AMY,Ca2+were measured by biochemical indicators and pathological changes were observed by HE staining.Results Serum TNF-α,IL-6,IL-10 levels were significantly increased in SAP model group compared to those of blank control(P<0.05). There were significant differences between SAP treated and SAP model group,and pancreas hemorrhage necrosis and inflammatory cells infiltration were significantly reduced(P<0.05).There were significant differences in the effect of Taohechengqi decoction and octreotide treatment on inflammatory factors and pancreatic pathological changes(P< 0.05),but with no combined interaction(P>0.05).Conclusions Taohechengqi decoction could reduce inflammatory factors,such as IL-6,TNF-α and increase anti-inflammatory factor IL-10 expressions in SAP rats. Then,it could relieve acute systemic inflammation and protect the pancreas of SAP rat,and hinder the development of SAP condition.

Severe acute pancreatitis；Taohechengqi decoction；Inflammatory factor；L-arginine

國家自然科學基金資助(No.81403302)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(No.21614306)；廣東省自然科學基金資助(2014A030310477)

吳先林(1984-)，男，博士，助理研究員，主要從事中西醫(yī)結合防治胰腺病研究。

鐘 健(1961-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科疾病診治研究。

R57

A

1005-9202(2015)12-3223-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.016

1 暨南大學附屬第一醫(yī)院校門診部

2 廣東省中醫(yī)院血管甲狀腺外科

3 暨南大學醫(yī)學院中醫(yī)系

4 暨南大學附屬第一醫(yī)院胰腺病診治中心