經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3在染料木黃酮抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖中的作用

凌藝輝 王 斌 吳建軍 蔣義國(guó) 楊巧媛

(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510182)

經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3在染料木黃酮抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖中的作用

凌藝輝 王 斌1吳建軍 蔣義國(guó) 楊巧媛

(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510182)

目的 旨在探討經(jīng)典瞬時(shí)受體電位(TRPC)通道(TRPC)3在染料木黃酮(Gen)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的作用。方法 用MTT法檢測(cè)癌細(xì)胞增殖活力，用熒光定量RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)TRPC通道表達(dá)水平，用1-油酰基-2-乙?；?sn-丙三醇(OAG)誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRPC3功能。結(jié)果 在所有Gen給藥濃度，H1299細(xì)胞增殖率均低于A549細(xì)胞(P<0.01)。H1299細(xì)胞的TRPC3 mRNA和蛋白表達(dá)都顯著高于A549細(xì)胞(P<0.01)。用shNC和shC3i質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，在Gen處理24、48、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，shC3i及Gen處理兩個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖率都低于shNC細(xì)胞(P<0.01)。在24、48 h，shC3i,shNC+Gen和shC3i+Gen三組間無(wú)差異，在72 h，shC3i+Gen組低于shC3i和shNC+Gen組(P<0.05)。Gen對(duì)shC3i細(xì)胞的增殖抑制率(9.9%)低于其對(duì)shNC細(xì)胞的增殖抑制率(56%)。Gen處理不影響H1299細(xì)胞TRPC3蛋白表達(dá)，但在OAG誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流檢測(cè)，shC3i細(xì)胞，Gen處理的shNC及shC3i細(xì)胞的瞬時(shí)鈣內(nèi)流均低于shNC細(xì)胞，Gen對(duì)shC3i細(xì)胞鈣內(nèi)流抑制作用低于其對(duì)shNC細(xì)胞鈣內(nèi)流抑制作用。結(jié)論 Gen抑制TRPC3通道功能可能是其抑制H1299細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

染料木黃酮;非小細(xì)胞肺癌;瞬時(shí)受體電位通道3;鈣;細(xì)胞增殖

肺癌是癌癥導(dǎo)致死亡的首要原因〔1〕。非小細(xì)胞肺癌病例占肺癌發(fā)生的80%～85%，其臨床療效不佳。大豆異黃酮是主要存在于大豆類食品中的一類植物化學(xué)物，對(duì)多種惡性腫瘤有預(yù)防和治療作用〔2〕。染料木黃酮(Gen)是大豆異黃酮中主要的成分，體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它對(duì)多種組織來源癌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用〔3～8〕。Gen通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，如核轉(zhuǎn)錄因子(NF)κB和蛋白激酶B(PKB)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)等，抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡，抑制遷移和侵襲〔2〕。鈣離子作為重要細(xì)胞信號(hào)分子參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，鈣離子及相關(guān)通道蛋白是近年來研究癌癥的重要靶分子。鈣庫(kù)操控鈣內(nèi)流(SOCE)和受體操控鈣內(nèi)流(ROCE)被認(rèn)為是非興奮細(xì)胞鈣內(nèi)流的主要鈣通道機(jī)制。Gen能抑制細(xì)胞的ROCE和SOCE〔9〕。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位(TRPCs)家族成員以同聚體或異聚體方式構(gòu)成細(xì)胞膜上離子通道，參與細(xì)胞SOCE和ROCE通道構(gòu)成。目前有關(guān)Gen對(duì)P53缺失的非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的抑制作用機(jī)制及TRPCs通道是否參與Gen的抑癌作用尚未見報(bào)道。本研究旨在探索TRPCs通道與Gen抑制非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 抗TRPC3抗體購(gòu)自Alomone Labs(Jerusalem,Israel)，抗GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德，二抗抗體購(gòu)自Cell Signaling(Danvers,MA,USA)。Gen和1-油?；?2-乙酰基-sn-丙三醇(OAG)購(gòu)自Sigma-aldrich公司。RNA提取用Trizol試劑，穩(wěn)定干擾質(zhì)粒構(gòu)建用pSilencerTMpuro試劑盒，T4連接酶，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用Lipofectamine2000脂質(zhì)體，F(xiàn)luo-4/AM熒光染料，胎牛血清和培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Invitrogen公司。蛋白提取，定量及蛋白免疫印跡試劑購(gòu)自Bio-Rad公司。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa寶生生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和H1299購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的Dulbecco modified Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 穩(wěn)定干擾細(xì)胞系建立 以TRPC3為目的基因的發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒按照pSilencerTMpuro試劑盒說明書構(gòu)建。干擾序列shC3i為5’-GGACUGAAAUGCUAAUUAUTT-3’，由Invitrogen公司合成。陰性對(duì)照shNC序列由試劑盒自帶。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染操作24 h后，用嘌呤霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。1個(gè)月后，用蛋白免疫印跡法鑒定干擾效率。

1.4 熒光定量RT-PCR及引物 按照Trizol說明書提取總RNA。濃度和純度檢測(cè)用紫外分光光度儀。TRPC1，TRPC3，TRPC4，TRPC6和β-actin的特異性引物合成參照文獻(xiàn)〔10〕。定量RT-PCR按照試劑盒說明書。用2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 蛋白免疫印跡 用全蛋白提取試劑盒說明提取全蛋白，用雙金雞寧酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行定量。50 μg總蛋白等量上樣，10%的SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶室溫封閉2 h后，抗TRPC3抗體用5%脫脂奶1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。用含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次后加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫下孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)熒光發(fā)光試劑顯影，檢測(cè)條帶。

1.6 細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞以100 μl/孔(2×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，每種5個(gè)復(fù)孔。24 h后，換成含二甲基亞砜(DMSO)或Gen的新鮮培養(yǎng)基。在設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加100 μl DMSO，震動(dòng)溶解甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。不同濃度Gen對(duì)細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)，以0劑量組為對(duì)照計(jì)算相對(duì)增殖率。Gen對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)，以給藥0 h為參照計(jì)算相對(duì)增殖率。半抑制率(IC50)用改良寇氏法計(jì)算。

1.7 Ca2+內(nèi)流實(shí)驗(yàn) 胞質(zhì)Ca2+濃度用Ca2+敏感性熒光染液Fluo-4/AM 染色標(biāo)記后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)(日本Olympus，F(xiàn)V1000-IX71)。細(xì)胞接種后，待生長(zhǎng)至50%左右，換成含DMSO或50 μmol/L Gen的新鮮培養(yǎng)基，藥物預(yù)處理4 h后，加入含2 μmol/L 的Fluo-4/AM的PBS，避光孵育30 min，PBS漂洗3 次，加入200 μl含2 mmol/L鈣的PBS，同時(shí)加入DMSO或50 μmol/L的Gen。綠色熒光Fluo-4激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。〔Ca2+〕i的變化用△F/F0 比值呈現(xiàn)，其中F0為未作任何處理時(shí)細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光值，△F = F-F0。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Gen對(duì)A549和H1299細(xì)胞增殖的抑制作用 各濃度Gen對(duì)H1299細(xì)胞增殖抑制作用均顯著高于對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.01)。Gen對(duì)A549細(xì)胞增殖的最大抑制率為(36.1±3.22)%，對(duì)H1299細(xì)胞增殖的最大抑制率為(86.5±3.9)%。說明H1299細(xì)胞對(duì)Gen的敏感性更高。見圖1。

與H1299比較：1)P<0.01

2.2 TRPCs通道分子在A549和H1299細(xì)胞的表達(dá)比較 TRPC5和TRPC7在兩種癌細(xì)胞未檢測(cè)到，TRPC1、4和6的表達(dá)在兩種細(xì)胞間無(wú)差異，而H1299細(xì)胞的TRPC3 mRNA表達(dá)水平顯著高于A549細(xì)胞(P<0.01)。進(jìn)一步用蛋白免疫印跡法檢測(cè)TRPC3蛋白表達(dá)情況，H1299細(xì)胞TRPC3蛋白表達(dá)比A549細(xì)胞高約1.5倍，差異顯著(P<0.01)。見圖2。

與A549比較：1)P<0.01

2.3 TRPC3干擾削弱Gen對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制作用 shC3i細(xì)胞中TRPC3蛋白表達(dá)量比shNC細(xì)胞中該分子表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。根據(jù)前面不同劑量Gen對(duì)H1299細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果計(jì)算半抑制率(IC50)為46.3 μmol/L，在此選擇IC50近似值50 μmol/L濃度處理兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)果顯示在3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，shNC+Gen、shC3i+Gen和shC3i細(xì)胞增殖水平都顯著低于shNC細(xì)胞(P<0.01)。在24、48 h，shNC+Gen、shC3i和shC3i+Gen三組間比較無(wú)差異(P>0.05)。在72 h，shC3i+Gen組細(xì)胞增殖率低于shNC+Gen和shC3i組(P<0.01)，且shNC+Gen組相對(duì)shNC組，增殖抑制率為56.01%，而shC3i+Gen組相對(duì)shC3i組，增殖抑制率為9.9%。見圖3。

與shNC組比較：1)P<0.01,與shC3i和shC3i+Gen組比較：2)P<0.05

2.4 Gen處理對(duì)TRPC3蛋白表達(dá)和通道鈣內(nèi)流的影響 用Gen處理H1299細(xì)胞，分別檢測(cè)在8、12、24 h的TRPC3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示Gen處理不影響TRPC3的蛋白表達(dá)。TRPC3參與細(xì)胞膜上鈣內(nèi)流通道構(gòu)成，能被細(xì)胞內(nèi)二?；视?DAG)直接激活，引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流。用DAG類似物OAG作為激動(dòng)劑，檢測(cè)H1299細(xì)胞表達(dá)TRPC3蛋白的功能以及Gen對(duì)此功能的影響。結(jié)果顯示，shC3i細(xì)胞及兩個(gè)Gen處理組細(xì)胞與shNC細(xì)胞相比，OAG誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的峰值和平臺(tái)期均顯著降低(P<0.01)。shC3i+Gen組細(xì)胞鈣瞬時(shí)升高的峰值低于shNC+Gen和shC3i組細(xì)胞，但只與shNC+Gen組細(xì)胞有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見圖4。

與shNC組比較，shNC+Gen組與shC3i+Gen組比較：1)P<0.01

3 討 論

人群病例對(duì)照和隊(duì)列研究報(bào)道，膳食異黃酮攝入與從不吸煙男性肺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)〔11，12〕。Gen是食物異黃酮中的重要成分，眾多的研究證明其對(duì)多種組織來源的癌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用〔2〕。在非小細(xì)胞肺癌，Gen抑制H460和H322細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)p21WAF1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡〔13〕。有研究者在A549細(xì)胞上進(jìn)一步證明Gen誘導(dǎo)p21WAF1表達(dá)依賴于P53蛋白表達(dá)〔14〕，Gen對(duì)P53缺失的H1299細(xì)胞生長(zhǎng)亦有較強(qiáng)的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，并未引起細(xì)胞凋亡增加。本研究用A549和H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞驗(yàn)證Gen對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果表明Gen對(duì)兩種細(xì)胞增殖均有抑制作用，抑制H1299細(xì)胞增殖呈明顯的濃度依賴性，且在所有給藥濃度組，對(duì)H1299細(xì)胞的抑制率更高。同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)胞TRPCs通道表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平，H1299細(xì)胞的TRPC3表達(dá)均顯著高于A549細(xì)胞。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)分子，通過調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，參與細(xì)胞的周期，增殖，分化，凋亡等生命過程。TRPC3與TRPC6基因序列有75%同源，它參與細(xì)胞膜上SOCE和ROCE通道組成，能被激素或各種生長(zhǎng)因子刺激而激活。研究表明TRPC6通道分子表達(dá)促進(jìn)乳腺癌，前列腺癌和肝癌等癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而TRPC3表達(dá)增高與在卵巢癌的發(fā)展相關(guān)，阻斷TRPC3和TRPC6通道或下調(diào)表達(dá)均抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔15〕。本研究也表明穩(wěn)定干擾的shC3i細(xì)胞比shNC細(xì)胞增殖活力明顯下降，同時(shí)抑制OAG誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流。說明功能性的TRPC3通道蛋白表達(dá)影響H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。但是用Gen處理H199細(xì)胞后，并未發(fā)現(xiàn)TRPC3蛋白表達(dá)發(fā)生改變。因此，推測(cè)Gen對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制作用可能是與通道活化相關(guān)，而不是直接調(diào)控分子表達(dá)。

在非興奮細(xì)胞，酪氨酸磷酸化是ROCE和SOCE活化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，研究表明Gen作為酪氨酸激酶抑制劑能抑制TRPC3通道介導(dǎo)的ROCE和SOCE〔16〕，而且此抑制作用對(duì)受體激動(dòng)或OAG激動(dòng)均有效。本文亦發(fā)現(xiàn)Gen預(yù)處理的shNC細(xì)胞，OAG誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流比未給藥shNC細(xì)胞明顯降低，這種藥物的抑制效果和單獨(dú)TRPC3干擾的抑制作用相同，但shC3i細(xì)胞給藥處理后與未給藥的shC3i細(xì)胞鈣內(nèi)流相比較，抑制效果明顯降低。說明TRPC3表達(dá)下調(diào)降低Gen對(duì)OAG誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的抑制作用。在增殖試驗(yàn)中同樣也發(fā)現(xiàn)，抑制TRPC3表達(dá)消除或削弱了Gen對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。這些結(jié)果提示Gen能抑制H1299細(xì)胞的TRPC3鈣通道活化，而且這種抑制作用可能是其對(duì)細(xì)胞增殖抑制的重要原因。綜上，本文結(jié)果提出了Gen抑制非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的一種可能的分子機(jī)制。

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〔2013-12-19修回〕

(編輯 苑云杰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102099)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013J4100036)

楊巧媛(1975-)，女，博士，副教授，主要從事環(huán)境致癌研究。

凌藝輝(1975-)，男，碩士，講師，主要從事癌癥化學(xué)預(yù)防研究。

R734

A

1005-9202(2015)12-3220-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.015

1 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)系