3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物與多糖的抗氧化活性研究

李 璐，姚 美, 張華峰，陳文杰，黎梅雨

(藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

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3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物與多糖的抗氧化活性研究

李 璐，姚 美, 張華峰*，陳文杰，黎梅雨

(藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

提取得到了韭菜(Alliumtuberosum)、大蔥(Alliumfistulosum)和小蔥(Alliumascalonicum)3種蔥屬蔬菜的水提物、醇提物與多糖，采用苯酚-硫酸比色法測定了3種蔥屬蔬菜的多糖含量，采用ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]和DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)方法比較研究了3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物和多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明，韭菜、大蔥和小蔥多糖含量的平均值分別為11.40%、22.57%和15.97%。韭菜、大蔥、小蔥的水提物、醇提物和多糖均具有抗氧化活性，基于量效關(guān)系建立的數(shù)學模型具有較高的擬合度。3種蔥屬蔬菜醇提物、水提物的抗氧化活性明顯高于多糖。不同種蔥屬蔬菜的抗氧化活性差異較大，其中韭菜水提物、醇提物和多糖的抗氧化活性最高，ABTS·+自由基清除率的EC50值分別為27.46、15.58、2.05×103，DPPH自由基清除率的EC50值分別為66.41、25.48、3.16×107，韭菜醇提物對ABTS·+自由基的清除能力與維生素C(Vc)接近。韭菜醇提物、水提物的抗氧化活性較高，具有一定的開發(fā)利用價值。

抗氧化活性； 蔥屬蔬菜； 水提物； 醇提物； 多糖

百合科蔥屬植物韭菜(Alliumtuberosum)、大蔥(Alliumfistulosum)和小蔥(Alliumascalonicum)既是重要的蔬菜作物，也具有較高的保健功效。據(jù)《本草綱目》記載，“正月蔥，二月韭”具有醫(yī)治胸痹急痛、傷寒勞復(fù)、風濕身痛、消渴等功效。Lee等[1]證明韭菜中的硫化物可以抑制人類結(jié)腸癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡；Jung等[2]發(fā)現(xiàn)大蔥中的果聚糖具有抗甲型流感病毒的作用；Sung等[3]證明大蔥有助于改善肥胖和代謝失調(diào)；Owoyele等[4]發(fā)現(xiàn)小蔥的乙醇提取物(簡稱醇提物)可使雄性大鼠的高密度脂蛋白含量降低、白細胞含量升高；Wongmekiat等[5]證明小蔥的水提物能夠保護雄性大鼠由環(huán)孢素A引起的腎損傷；Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)紅皮洋蔥(Alliumcepa)提取物的抗氧化活性顯著高于黃皮洋蔥?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，正常人體內(nèi)的自由基生成與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當自由基動態(tài)平衡被打破時，就會出現(xiàn)各種氧化損傷，從而加速機體衰老并誘發(fā)腫瘤等多種疾病[7-8]。研究和開發(fā)安全、高效的天然抗氧化劑是食品科學和醫(yī)學領(lǐng)域的熱點課題[9]。韭菜、大蔥和小蔥風味獨特，安全無毒，在我國范圍內(nèi)廣泛種植，是我國居民的主要蔬菜。本研究以韭菜、大蔥和小蔥3種蔥屬蔬菜為試材，在分離制備水提物、醇提物與多糖的基礎(chǔ)上，對其體外抗氧化活性進行比較研究，以期為安全、高效抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)以及蔥屬蔬菜資源的深度開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

韭菜、大蔥和小蔥2013年7月采自陜西省西安市長安區(qū)。葡萄糖(純度>99%)、維生素C(Vc) (純度>99%)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自Sigma公司。無水乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚、α-萘酚等均采用分析純，購自西安市斯邁爾試劑儀器經(jīng)營部。

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；JPCQ0328型全數(shù)字式超聲波清洗機，武漢嘉鵬電子有限公司；DL-4C型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

(1) 蔬菜樣品處理 韭菜、大蔥和小蔥葉片經(jīng)挑選去雜后，用自來水、dH2O依次漂洗，然后切成長約1 cm的小段，在50℃烘干至恒重，粉碎過篩后取20～40目的樣品粉末避光保存(備用)。

(2) 水提物制備 取3種樣品粉末，分別按照1∶40料液比加入dH2O，在25 ℃超聲波輔助提取30 min[10]。離心取上清液，用0.45 μm水系濾膜過濾，冷凍干燥后密封4 ℃保存。

(3) 醇提物制備 取3種樣品粉末，分別按照1∶50料液比加入50%乙醇，置50 ℃水浴中浸泡2 h后超聲波輔助提取20 min[11]。離心取上清液，用0.45 μm有機系濾膜過濾，凍干后密封4 ℃保存。

(4) 多糖制備 參考文獻[10]，取3種樣品粉末，分別按照1∶40料液比加入dH2O，在100 ℃加熱提取3 h后，離心取上清液，加入4倍體積95%乙醇，離心取沉淀，依次用70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，再用Sevag法進一步純化，最后在55 ℃烘干得到多糖樣品。

1.2.2 多糖的定性與定量分析

(1) 多糖的定性 采用Molish反應(yīng)[12]定性鑒定多糖。

(2) 多糖的純度鑒定 參考文獻[13]，配制1 mg/mL多糖樣品溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，鑒定多糖純度。

(3) 多糖的含量測定 采用苯酚-硫酸比色法[12,14]測定多糖含量，簡述如下：分別量取300 μL 5%苯酚溶液至8支試管中，各加入0.10 mg/mL葡萄糖標準溶液0、50、100、200、300、400、500、600 μL，用dH2O補足體積至1 mL，再各加入2.5 mL濃硫酸，振蕩混勻后在20℃水浴中顯色反應(yīng)5 min，然后在490 nm波長下測定吸光度，以葡萄糖標準溶液的濃度x為橫坐標、吸光度平均值y為縱坐標繪制標準曲線(圖1)。按照相同方法對多糖樣品溶液進行顯色，通過比色分析即可測定多糖含量。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Calibration curve of glucose

1.2.3 自由基清除實驗 采用本實驗室優(yōu)化的ABTS·+、DPPH自由基清除實驗方法[8]考察3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物及多糖的抗氧化作用。ABTS·+實驗簡述如下：將等體積的7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液均勻混合，避光反應(yīng)12 h后稀釋得到ABTS·+溶液。實驗設(shè)樣品組和對照組。樣品組中，將4 mL ABTS·+溶液加入1 mL樣品溶液中，混勻后避光反應(yīng)6 min，立即在734 nm波長下測定吸光度；第一對照組中，用1 mL dH2O代替1mL樣品溶液；第二對照組中，用4 mL無水乙醇代替4 mL ABTS·+溶液。DPPH實驗簡述如下：用無水乙醇配制0.04 mg/mL的DPPH溶液。實驗設(shè)樣品組和對照組。樣品組中，在1 mL樣品溶液中加入2 mL DPPH溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，立即在517 nm波長下測定吸光度；第一對照組用1 mL dH2O代替1 mL樣品溶液；第二對照組用2 mL無水乙醇代替2 mL DPPH溶液。自由基清除率的計算公式為：I=(1-(Ax-A2)/A1)×100%。式中：I為多糖對自由基的清除率，A1為第一對照組吸光度，A2為第二對照組吸光度，Ax為樣品組吸光度。參考文獻[11]計算相對半效劑量(EC50)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 運用SPSS 12.0軟件統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，多重比較采用One-Way ANOVA分析和最小顯著差數(shù)(LSD)的t檢驗方法，P<0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 多糖的制備與檢測

采用水提醇沉法提取3種蔥屬蔬菜多糖，采用有機溶劑分級分離法和Sevag法純化多糖，制得了淺棕色的多糖固體。光譜掃描發(fā)現(xiàn)，多糖樣品在200 nm波長附近有多糖特征性吸收峰，在260、280 nm及特定紫外區(qū)無明顯光吸收(圖2)，表明多糖樣品中不含核酸、蛋白質(zhì)及多酚等雜質(zhì)[15]。多糖樣品的Molish反應(yīng)呈陽性，說明其中確實含有多糖成分。韭菜、大蔥和小蔥多糖的含量各不相同，依次為11.40%、22.57%和15.97%(表1)，說明蔥屬蔬菜多糖水平的種間差異較大(P<0.05)。

圖2 3種蔥屬蔬菜多糖樣品掃描光譜Fig.2 Scanning spectra of polysaccharides from 3 Allium species

表1 3種蔥屬蔬菜多糖的含量Tab.1 Contents of polysaccharides in 3 Allium species

注：數(shù)值右側(cè)的不同上標表示顯著差異。

2.2 對ABTS·+自由基的清除作用

如圖3所示，3種蔥屬蔬菜水提物對ABTS·+自由基的清除能力由大到小依次為韭菜、小蔥、大蔥，并且清除率與水提物量呈正相關(guān)。由表2可知，3種蔬菜醇提物、水提物的ABTS·+自由基清除能力較強，而多糖的清除能力較差。3種蔬菜水提物擬合方程的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.948 2～0.974 6，說明數(shù)學模型能較好地反映水提物量與自由基清除率之間的量效關(guān)系。韭菜水提物對ABTS·+自由基的清除能力很強，EC50值為27.46，高于Vc，但顯著低于小蔥和大蔥(P<0.05)。

圖3 3種蔥屬蔬菜水提物對ABTS·+自由基的清除作用Fig.3 ABTS·+ radical-scavenging capacities of water extract from 3 Allium species

表2 3種蔥屬蔬菜的ABTS·+自由基清除活性 及其量效關(guān)系數(shù)學模型Tab.2 ABTS·+ radical-scavenging activity and mathematical model of dose-effect relationship of 3 Allium species

注：擬合方程中，y為自由基清除率，x為提取物量；EC50為相對半效劑量，其數(shù)值受待測物濃度影響(具體計算方法參考文獻[11])，EC50數(shù)值右側(cè)的不同上標表示顯著差異。下表同。

如圖4所示，3種蔬菜醇提物均具有較強的ABTS·+自由基清除能力。在醇提物量為60 μL時，韭菜、大蔥和小蔥的清除率都達到80%。在試驗范圍內(nèi)，醇提物的自由基清除能力呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。由表2可知，3種蔬菜擬合方程的相關(guān)系數(shù)為0.917 3～0.992 7，說明數(shù)學模型能較好地反映醇提物量與自由基清除率之間的量效關(guān)系。此外，韭菜、小蔥、大蔥醇提物的EC50值分別為15.58、16.29、19.91，相比于Vc的EC50值(4.18)，可知3種蔥屬蔬菜的醇提物都具有一定的抗氧化活性，其中韭菜醇提物的ABTS·+自由基清除能力與Vc比較接近。

圖4 3種蔥屬蔬菜醇提物對ABTS·+自由基的清除作用Fig.4 ABTS·+ radical-scavenging capacities of ethanol extract from 3 Allium species

如圖5所示，3種蔬菜多糖的ABTS·+自由基清除能力也呈現(xiàn)出劑量依賴性。3種蔬菜多糖的ABTS·+自由基清除能力均較差，韭菜多糖的自由基清除能力顯著高于大蔥和小蔥(P<0.05)(表3)。

圖5 3種蔥屬蔬菜多糖對ABTS·+自由基的清除作用Fig.5 ABTS·+ radical-scavenging capacities of polysaccharides from 3 Allium species

2.3 對DPPH自由基的清除作用

由表3可知，3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物的DPPH自由基清除能力較強，而多糖的清除能力較差，這與ABTS·+實驗的結(jié)論相一致(表2)。一般來說，植物水提物中含有較多的酚類化合物，此外還含有少量黃酮類化合物、蛋白質(zhì)、單寧、糖類、有機酸等[10,16]；醇提物中含有較多的黃酮類化合物，此外還含有酚類化合物、蒽醌、萜類化合物、香豆素等[11]。黃酮類化合物和多酚等往往具有較強的抗氧化活性[6-7]。3種蔥屬蔬菜醇提物、水提物的抗氧化活性顯著優(yōu)于多糖，可能與其中含有較多的黃酮類化合物、多酚有關(guān)。3種蔬菜水提物、醇提物、多糖擬合方程的相關(guān)系數(shù)為0.943 6～0.987 3(表3)，說明數(shù)學模型能較好地反映提取物量與DPPH自由基清除率之間的量效關(guān)系。

表3 3種蔥屬蔬菜的DPPH自由基清除活性及其量效關(guān)系數(shù)學模型Tab.3 DPPH radical-scavenging activity and mathematical model of dose-effect relationship of 3 Allium species

如圖6所示，3種蔬菜水提物的DPPH自由基清除率隨著水提物量的增加而增大，自由基清除能力由大到小依次為韭菜、大蔥、小蔥。由表3也可看出，大蔥和小蔥的EC50值約為韭菜的二倍，表明韭菜對DPPH自由基的清除能力遠大于大蔥和小蔥。

圖6 3種蔥屬蔬菜水提物對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging capacities of water extract from 3 Allium species

如圖7所示，3種蔬菜醇提物均具有較強的DPPH自由基清除能力。在試驗范圍內(nèi)，蔬菜樣品的自由基清除率隨著醇提物量的增加而升高。在醇提物量為140 μL時，韭菜、大蔥和小蔥的清除率皆達到92%。由表3可知，韭菜醇提物的EC50值最低(25.48)，大蔥和小蔥次之(EC50值分別為26.77和34.70)，表明3種蔥屬蔬菜中韭菜的DPPH自由基清除能力最強。

圖7 3種蔥屬蔬菜醇提物對DPPH自由基的清除作用Fig.7 DPPH radical-scavenging capacities of ethanol extract from 3 Allium species

如圖8所示，3種蔬菜多糖的DPPH自由基清除能力亦呈劑量依賴性。由表3可知，3種蔬菜多糖的DPPH自由基清除能力均明顯低于Vc(P<0.05)；相對而言，韭菜多糖的抗氧化能力高于小蔥和大蔥。

圖8 3種蔥屬蔬菜多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH radical-scavenging capacities of polysaccharides from 3 Allium species

3 結(jié)論

韭菜、大蔥、小蔥3種蔥屬蔬菜的水提物、醇提物和多糖均具有一定的抗氧化活性?？寡趸钚跃哂忻黠@的劑量依賴性，基于量效關(guān)系建立的數(shù)學模型具有較高的擬合度。醇提物、水提物的抗氧化活性明顯高于多糖。在3種蔥屬蔬菜中，韭菜水提物、醇提物和多糖的抗氧化活性最高，韭菜醇提物對ABTS·+自由基的清除能力與Vc比較接近。大蔥多糖含量最高，小蔥次之，韭菜最低，但是韭菜多糖的抗氧化活性明顯高于大蔥和小蔥。不同種蔬菜多糖的含量及水提物、醇提物和多糖的抗氧化活性差異較大?？傮w上看，韭菜醇提物、水提物的抗氧化活性較高，值得進一步研究和開發(fā)。

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〔責任編輯 宋軼文〕

Antioxidant activities of water extract, ethanol extract and polysaccharides among threeAlliumspecies

LI Lu, YAO Mei, ZHANG Huafeng*, CHEN Wenjie, LI Meiyu

(Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry,National Engineering Laboratory for Resources Development of Endangered Crude Drugs in Northwest China,School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

After water extract, ethanol extract and polysaccharides，threeAlliumspecies, includingA.fistulosumandA.ascalonicum, contents of polysaccharides in these threeAlliumspecies were determined by phenol-sulfuric acid method, and their antioxidant activities were evaluated by ABTS (2,2′-azino-bis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) and DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) assays. Average contents of polysaccharides inA.tuberosum,A.fistulosumandA.ascalonicumwere 11.40%, 22.57% and 15.97%, respectively. Both ABTS· +and DPPH radical-scavenging capacities were dose dependent, and mathematical model based on dose-effect relationship had high goodness of fit. Antioxidant activities of water extract, ethanol extract were significantly better than those of polysaccharides. The three species exhibited different antioxidant capacities. Among them, antioxidant activities ofA.tuberosumwere higher. EC50values of ABTS·+radical-scavenging capacity of water extract, ethanol extract and polysaccharides fromA.tuberosumwere 27.46, 15.58, 2.05×103, respectively, and EC50values of DPPH radical-scavenging capacity were 66.41, 25.48, 3.16×107, respectively. In particular, ABTS+radical-scavenging capacity of ethanol extract was relatively close to that of vitamin C(Vc). To sum up, antioxidant activities of ethanol extract and water extract fromA.tuberosumwere relatively high, which showed great potential for exploitation and utilization.

antioxidant activity;Allium; water extract; ethanol extract; polysaccharides

1672-4291(2015)03-0098-06

10.15983/j.cnki.jsnu.2015.03.136

2014-07-08

陜西省科技合作計劃項目(2014SJ-01)； 陜西師范大學勤助科研創(chuàng)新基金項目(QZYB13043)

李璐，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)學。E-mail:liluacademic@yahoo.com

*通信作者：張華峰，男，副教授，博士。E-mail:isaacsau@sohu.com

TS255.1

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