銀杏內(nèi)酯B前體藥物的腦靶向性研究

朱世璟，袁 媛,2，尹華陽，惠愛玲，周 安，潘 見

(1.合肥工業(yè)大學(xué)天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034; 3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

銀杏內(nèi)酯B前體藥物的腦靶向性研究

朱世璟1，袁 媛1,2，尹華陽1，惠愛玲1，周 安3，潘 見1

(1.合肥工業(yè)大學(xué)天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034; 3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

目的 考察銀杏內(nèi)酯B前體藥物(PGB)的腦靶向性，并探究其靶向機(jī)制。方法 采用LC-MS/MS考察大鼠尾靜脈注射PGB后的腦部藥動(dòng)學(xué)規(guī)律并評(píng)價(jià)其腦靶向性；采用伊文斯藍(lán)法觀察PGB對(duì)不完全性腦缺血小鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響；HPLC法測(cè)定PGB在正辛醇-水體系的分配系數(shù)(logP)；MVD分子對(duì)接軟件計(jì)算PGB與P-糖蛋白(P-gp)的體外結(jié)合力；定磷法檢測(cè)PGB對(duì)人P-gp膜ATP酶活性的影響。結(jié)果 以治療有效性和靶向指數(shù)評(píng)價(jià)PGB的腦靶向效率達(dá)6.87和4.14；PGB預(yù)防給藥可有效降低不完全性腦缺血小鼠的腦毛細(xì)血管通透性(P<0.05)；PGB的 logP為1.03，高于GB的0.61；分子對(duì)接計(jì)算表明PGB與P-gp結(jié)合力大于GB，其MolDockScore分別為-143.36、-116.40 KJ·mol-1；ATP酶活性分析提示PGB、GB均能提高P-gp ATP酶活性，其Km值分別為237.75、841.24 μmol·L-1, PGB與P-gp親和力高于GB。結(jié)論 PGB具有腦靶向性，其靶向性提高一方面得益于其脂溶性提高，PGB在腦部滲透量增加；另一方面可能為PGB明顯提高P-gp ATP 酶活性，從而抑制P-gp對(duì)GB的外排作用。

銀杏內(nèi)酯B；前體藥物；腦靶向；腦缺血；脂水分配系數(shù)；P-糖蛋白；ATP酶活性

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, GBE)是臨床治療腦血管疾病的一線藥物，療效得到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界充分肯定。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B, GB)是GBE中重要的活性成分之一，GB是血小板活化因子(platelet activation factor, PAF)受體最有效的拮抗劑[1]，它可減輕腦缺血/再灌注介導(dǎo)的腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高自由基清除系統(tǒng)酶的活性，對(duì)腦損傷有明顯保護(hù)作用[2-3]。

然而，GB的藥代研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其在腦部濃度非常低[4-5]，如：尾靜脈注射GB (10 mg·kg-1) 20 min后腦部濃度僅為0.24 μg·g-1[4]。這里除了腦細(xì)胞對(duì)GB的清除效應(yīng)外，其血腦屏障(blood brain barrier, BBB)對(duì)藥物的屏障作用及BBB上P-糖蛋白(p-glycoprotein, P-gp)對(duì)藥物的外排作用亦不容忽視[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)室以提高GB腦靶向性、增強(qiáng)藥效為目的，設(shè)計(jì)合成了一系列GB腦靶向前藥[7-8]，如酯類前藥PGB(Fig 1)，它是在GB的10位羥基位置引入另一分子T而得到。T具有鈣離子拮抗作用，同時(shí)對(duì)P-gp也具有一定的抑制作用。前期研究結(jié)果證實(shí)：PGB保留GB的抗血小板聚集活性[9]，同時(shí)增加了拮抗鈣離子通道蛋白的作用[7]。

PGB是作用于腦部而發(fā)揮藥效的藥物，所以對(duì)其腦靶向性評(píng)價(jià)及對(duì)腦缺血的保護(hù)作用研究尤為重要。為此，本文采用LC-MS/MS法，考察大鼠尾靜脈注射PGB后的腦部藥動(dòng)學(xué)規(guī)律并評(píng)價(jià)其腦靶向性；采用頸動(dòng)脈結(jié)扎致小鼠不完全性腦缺血模型，通過伊文斯藍(lán)法考察PGB對(duì)缺血小鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響。在證實(shí)PGB具有腦靶向作用的基礎(chǔ)上，深入探究其靶向機(jī)制將為其它藥物的腦靶向前藥設(shè)計(jì)提供科學(xué)指導(dǎo)。

理論上來說，BBB通透性增加及P-gp外排功能減弱均有利于增加PGB的腦部濃度，從而提高其腦靶向效率。為此，我們采用搖瓶法，結(jié)合HPLC測(cè)定PGB在正辛醇-水體系的脂水分配系數(shù)(logP)，以此推測(cè)PGB的BBB通透性。P-gp結(jié)合力(親和力)大小直接影響P-gp外排功能的強(qiáng)弱，在此，我們分別采用Molegro Virtual Docker (MVD)分子對(duì)接軟件計(jì)算PGB、GB與P-gp的結(jié)合力大??；并以ATPase活性分析法測(cè)定PGB、GB對(duì)人P-gp膜ATP酶活性的影響，以考察它們與P-gp的親和力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 PGB為本實(shí)驗(yàn)室合成，其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、NMR、MS確證，純度>99%；GB為合肥拓峰生物工程有限公司提供，純度≥ 98%；鹽酸維拉帕米為武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司提供，純度99%；HPLC級(jí)甲醇購自美國Tedai公司；伊文斯藍(lán)購自BIOSHARP公司；人P-gp膜購自美國BD公司；Tris、MES、DL-二硫蘇糖醇(DTT)購自薩恩(上海)化學(xué)技術(shù)有限公司；甲酰胺、正釩酸鈉、Mg-ATP、消泡劑A、SDS購自美國Sigma公司；其它試劑購自國藥集團(tuán)，均為分析純。

1.1.2 儀器 API 3200型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件，美國Applied Biosystem公司；高效液相色譜系統(tǒng)，配有515高壓泵、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)、2487紫外光譜檢測(cè)器(UVD)、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司；Spectra Max M2e 多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；標(biāo)準(zhǔn)PB-10酸度計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，♀♂兼用，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(皖)2005-001；SPF級(jí)昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002。動(dòng)物自由進(jìn)食，飲水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫(18～22)℃，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 PGB腦靶向性評(píng)價(jià)

1.2.1.1 動(dòng)物分組及給藥 SD大鼠隨機(jī)分為PGB組(12.83 mg·kg-1)或GB組(10 mg·kg-1)，尾靜脈注射給藥，于給藥后0.08、0.17、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h時(shí)經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血，置于預(yù)先肝素化的試管中，4℃離心 (4 000 r·min-1，10 min)，精密吸取上層血漿，于-20℃保存，待測(cè)。取血后立即取出腦組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重后加入4倍量生理鹽水(kg·L-1)制成腦勻漿，于-20℃保存，待測(cè)。

1.2.1.2 生物樣品處理 精密吸取血漿或腦勻漿190 μl，加入GA溶液(4 mg·L-1，內(nèi)標(biāo))5.0 μL，混勻后加入乙酸乙酯1.0 mL，渦旋振蕩3 min，4℃離心 (12 000 r·min-1，10 min)，取上層有機(jī)相，40℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，離心10 min，取上清液。其中血漿樣品的上清液稀釋10倍，腦勻漿樣品不稀釋，取10 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.2.1.3 測(cè)定條件[10]色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry shield RP18 (3.9 mm×150 mm ID，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液(85 ∶15，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI離子源；負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式；電噴霧電壓(IS)-4500 V；離子源溫度(TEM)500℃；定量分析的離子對(duì)：PGB，[M-H]-，m/z 543.3/137.2；GB，[M-H]-，m/z 423.6→367.1和GA，[M-H]-，m/z 407.2→350.8。

1.2.1.4 腦靶向性評(píng)價(jià)[11]采用中國藥理學(xué)會(huì)編制的3P97藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件，計(jì)算靜脈注射藥物后血漿及腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并以治療有效性(therapeutic availability, TA)和靶向指數(shù)(drug targeting index, DTI)定量評(píng)價(jià)PGB的腦靶向特性。

式中：AUC表示藥物從零時(shí)間至所有原形藥物全部消除這一段時(shí)間的藥-時(shí)曲線下面積。

AUCbrain(PGB)、AUCbrain(GB)分別表示注射PGB和原藥GB后的腦內(nèi)GB的AUC。

AUCblood(PGB)、AUCblood(GB)分別表示注射PGB和原藥GB后的血漿內(nèi)GB的AUC。

1.2.2 PGB對(duì)不完全性腦缺血模型小鼠腦毛細(xì)管通透性的影響 SPF級(jí)小鼠按體質(zhì)量均衡隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、GB組(5 mg·kg-1)、PGB高、中、低劑量(10、5、2.5 mg·kg-1)組。除假手術(shù)組、模型組外，其余各組均腹腔注射給藥，給藥容積為5 mL·kg-1，假手術(shù)組、模型組給予等容積的溶媒，每3 d稱量體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥容量，連續(xù)腹腔注射7 d。

d 8各組小鼠用5.25%水合氯醛溶液麻醉，手術(shù)分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，打開雙側(cè)動(dòng)脈夾，縫合頸部皮膚。休息2 h后由尾靜脈注射2.5% 伊文斯藍(lán)溶液 (10 mL·kg-1)。注射1 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，開顱取腦，將腦組織浸于生理鹽水中清洗，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱重，將腦組織浸泡于腦質(zhì)量10倍體積(kg·L-1)的甲酰胺中， 45℃培養(yǎng)箱溫育72 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，于620 nm處，酶標(biāo)儀測(cè)光密度(OD)值。

1.2.3 PGB脂水分配系數(shù)測(cè)定[12]

1.2.3.1 測(cè)定條件 色譜柱：Symmetry shied C18柱(250×4.6 mm, 5 μm)；測(cè)定GB時(shí)的其它色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水-四氫呋喃(30 ∶60 ∶10，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氮?dú)?5 psi，增益值100，漂移管60℃，蒸發(fā)器級(jí)別60%。

測(cè)定PGB時(shí)的其它色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(55 ∶45，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25℃；紫外檢測(cè)波長275 nm。進(jìn)樣量均為10 μL。

1.2.3.2 樣品配制 精密配制濃度為1.0及 0.1 g·L-1的PGB、GB正辛醇(二次蒸餾水飽和)溶液，避光保存，備用。

1.2.3.3 平衡時(shí)間確定 分別取0.1、1.0 g·L-1PGB正辛醇溶液10 mL于錐形瓶中，加入10 mL二次蒸餾水(正辛醇飽和)混合振蕩。分別振蕩1、2、3、4、5、6 h后，分離水相和有機(jī)相，檢測(cè)水相中PGB濃度。當(dāng)濃度不再增加時(shí)，即為平衡時(shí)間。同法確定GB正辛醇溶液的平衡時(shí)間。

1.2.3.4 脂水分配系數(shù)測(cè)定 分別取0.1 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL與10 mL二次蒸餾水(1 ∶1)混合，25℃下振蕩3 h (根據(jù)1.2.3.3結(jié)果確定)；另取1.0 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL與50 mL二次蒸餾水(1 ∶5)混合，25℃下振蕩5 h(根據(jù)1.2.3.3結(jié)果確定)。上述各溶液振蕩后分離有機(jī)相和水相，分別測(cè)定兩相中PGB、GB濃度。

正辛醇/水分配系數(shù)以log P表示，其計(jì)算公式為：

式中：Co表示化合物在正辛醇中的濃度，Cw表示化合物在水相中的濃度。

1.2.4 PGB與P-gp結(jié)合力的分子對(duì)接計(jì)算[13]采用MVD軟件模擬配體分子與受體蛋白的結(jié)合力或親和力。這里的受體蛋白為P-gp，它的晶體結(jié)構(gòu)[14]來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank, PDB)的鼠P-gp PDB code：3G5U)；配體分子選擇PGB、GB、T 和維拉帕米(verapamil, Ver)。T分子是PGB結(jié)構(gòu)(Fig 1)中具有P-gp抑制作用的活性分子；Ver是一種常用的P-gp抑制劑，可激活P-gp的ATP酶活性。在分子對(duì)接過程中，采用準(zhǔn)確性較高的MolDock打分算法，MolDock Score 絕對(duì)值越大，配體分子與P-gp結(jié)合力越大。結(jié)合力越大，越易被P-gp外排，從而可以使同時(shí)存在的其它分子的外排受到抑制。

Fig 1 Chemical structures of GB and PGB

1.2.5 PGB對(duì)人P-gp 膜ATP酶活性的影響[15-16]

1.2.5.1 溶液配制 反應(yīng)基質(zhì)液：稱取EGTA 75.8 mg、KCl 187.3 mg、DTT 31.2 mg、NaN332.5 mg溶于100 mL Tris-MES 緩沖液(PH 6.8)得到反應(yīng)基質(zhì)液。

標(biāo)準(zhǔn)Pi溶液：稱取NaH2PO430.0 mg溶于10 mL反應(yīng)基質(zhì)液得到3 g·L-1的NaH2PO4儲(chǔ)備液。用反應(yīng)基質(zhì)液稀釋至0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05 g·L-1，即為標(biāo)準(zhǔn)Pi溶液。

藥物溶液：(1) PGB或GB溶液：分別稱取8.2 mg PGB 或6.4 mg GB，用反應(yīng)基質(zhì)液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的PGB或GB母液，并稀釋至750、300、150、30 μmol·L-1；(2) Ver溶液：稱取7.4 mg鹽酸維拉帕米，用反應(yīng)基質(zhì)液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的Ver母液，并稀釋至750、300、150、30 μmol·L-1。

P-gp膜溶液：取人P-gp膜母液 (5 g·L-1)于37℃水浴快速解凍，用反應(yīng)基質(zhì)液稀釋至1 g·L-1，置于冰上待用。

正釩酸鈉工作液：稱取正釩酸鈉27.5 mg溶于5 mL反應(yīng)基質(zhì)液，取其中的100 μL溶液用反應(yīng)基質(zhì)液稀釋至10 mL，得到300 μmol·L-1的正釩酸鈉工作液。

Mg-ATP液：稱取Mg-ATP 31.2 mg，溶于5 mL反應(yīng)基質(zhì)液，得到12 mmol·L-1的Mg-ATP溶液。

反應(yīng)終止液和顯色液：稱取SDS 1.01g溶于10 mL蒸餾水，加入20 μL消泡劑A，配成SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%含0.2%消泡劑A的反應(yīng)終止液；稱取鉬酸銨432.6 mg、醋酸鋅27.5 mg，用蒸餾水溶解并定容至10 mL得到顯色劑A。稱取抗壞血酸4 g，溶于36 mL蒸餾水，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%抗壞血酸溶液，此為顯色劑B。使用時(shí)兩種溶液以1 ∶4 (V/V)混合作為顯色劑。

1.2.5.2 試驗(yàn)分組 非P-gp ATP酶活性組(正釩酸鈉+P-gp膜)；陽性對(duì)照組(Ver系列濃度+P-gp膜)；試驗(yàn)組(GB或PGB系列濃度+P-gp膜)。

1.2.5.3 反應(yīng)孵育條件 反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行。P-gp膜溶液和試驗(yàn)藥物溶液各20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱5 min，隨后加入20 μL 37℃預(yù)熱5 min的Mg-ATP溶液，開始反應(yīng)。另將含有正釩酸鈉的反應(yīng)液作為對(duì)照，以排除P-gp制作過程中非P-gp ATP酶活性和非酶作用的ATP水解的影響。該反應(yīng)液(60 μL)在37℃孵育相應(yīng)時(shí)間，之后每孔加入30 μL反應(yīng)終止液，再加入200 μL顯色劑(含40 μL顯色劑A和160 μL顯色劑B)，37℃孵育20 min，多功能酶標(biāo)儀在620 nm處測(cè)吸光度。

1.2.5.4 Pi標(biāo)準(zhǔn)曲線 將配制好的0～0.3 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)Pi溶液接種于96孔板上，每孔60 μL，每個(gè)濃度平行5孔，37℃孵育30 min后，加入30 μL反應(yīng)終止液，其余按1.2.5.3項(xiàng)下處理。

1.2.5.5 時(shí)間-ATP酶活性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)分組，分別在96孔板中加入正釩酸鈉工作液、300 μmol·L-1Ver溶液、300 μmol·L-1GB溶液或PGB溶液各20 μL，每組平行3孔。隨后每孔加入稀釋后的P-gp膜溶液20 μL，37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱5 min，最后加入37℃預(yù)熱的Mg-ATP溶液20 μL，混勻后37 ℃分別孵育0、15、30、45、60 min。其余按1.2.5.3處理。根據(jù)Pi標(biāo)準(zhǔn)曲線求算反應(yīng)釋放的無機(jī)磷量，繪制ATP酶活-時(shí)間曲線。

1.2.5.6 濃度-ATP酶活性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)分組，分別在96孔板中分別加入正釩酸鈉工作液、Ver、GB、PGB系列工作液(1500、750、300、150、30 μmol·L-1)各20 μL，每一濃度平行3孔。隨后每孔加入稀釋后的P-gp膜溶液20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱5 min，再加入37℃預(yù)熱的Mg-ATP溶液20 μL，混勻后37℃孵育60 min(根據(jù)1.2.5.5結(jié)果確定)，之后按1.2.5.3處理。根據(jù)Pi標(biāo)準(zhǔn)曲線求算反應(yīng)釋放的無機(jī)磷量，繪制ATP酶活-藥物濃度曲線。

1.2.5.7 數(shù)據(jù)處理 將所測(cè)得的ATP酶活性數(shù)據(jù)代入米氏方程

其中，V和Vmax分別為藥物激活的ATP酶活性及其最大值，Km為米氏常數(shù)，即ATP酶活為最大值一半時(shí)的底物濃度；C代表底物濃度。

2 結(jié)果

2.1 PGB腦靶向性評(píng)價(jià)大鼠尾靜脈注射PGB，給藥5 min后在腦勻漿中即檢測(cè)到PGB以及PGB降解的GB。與直接注射GB(以GB0表示)相比，注射PGB后在腦勻漿檢測(cè)到的GB(以GB(PGB)表示)濃度均有較大幅度提高。注射PGB或GB后，在血漿和腦勻漿檢測(cè)到的藥物濃度數(shù)據(jù)以及它們的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)列于Tab 1和2。由“1.2.1.4”下的公式計(jì)算TA為6.87，DTI為4.14，這表明將GB改造成PGB后，PGB可以迅速通過BBB，且腦靶向性大大提高。同時(shí)，我們也觀察到PGB降解GB的腦內(nèi)半衰期(T1/2)延長，清除率(CL)下降，PGB呈現(xiàn)出一種長效緩釋特性，這對(duì)于腦血管疾病的長期用藥是非常有利的。

Tab 1 Concentrations of drugs in rat plasma and brain tissue afterintravenous administration of PGB and GB ±s，n=6)

2.2 PGB對(duì)不完全性腦缺血模型小鼠腦毛細(xì)管通透性的影響小鼠腹腔注射連續(xù)給藥7d后，模型組與假手術(shù)組相比，伊文斯藍(lán)通過小鼠腦毛細(xì)血管的量明顯增加，這說明不完全性腦缺血小鼠模型復(fù)制成功(P<0.05)，如Tab 3所示。GB給藥組的伊文斯藍(lán)透過量與模型組相比有所減少，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PGB低、中、高劑量組的伊文斯藍(lán)透過量均低于模型組，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中PGB高劑量組的降低程度最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PGB對(duì)不完全性腦缺血小鼠的保護(hù)作用強(qiáng)于GB，這可能也得益于PGB的腦靶向性提高。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of drugs in rat plasma and brain tissue

Tab 3 Cerebral capillary permeabilityin cerebral ischemia ±s)

*P<0.05vsvehicle.

2.3 PGB脂水分配系數(shù)測(cè)定PGB的脂水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果見Tab 4。由表可知，將GB制成前藥PGB后其親脂性增強(qiáng)(logP=1.03)，更易穿透BBB到達(dá)腦部。

Tab 4 Lipo-hydro partition coefficient of PGB

2.4 PGB與P-gp結(jié)合力的分子對(duì)接計(jì)算各配體與P-gp的分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果見Tab 5。由MolDock Score計(jì)分?jǐn)?shù)據(jù)預(yù)測(cè)配體分子與P-gp的結(jié)合力，其結(jié)合力大小排序?yàn)椋篜GB >GB ≥Ver>T。PGB與P-gp結(jié)合力大于GB，即當(dāng)腦內(nèi)同時(shí)存在PGB和降解的GB時(shí)，PGB由于結(jié)合力大優(yōu)先被外排出腦，從而減弱了P-gp對(duì)GB的外排作用，最終使GB的腦內(nèi)濃度升高。

Tab 5 Docking results of drugs with P-gp

2.5 PGB對(duì)P-gp 膜ATP酶活性的影響

2.5.1 Pi濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 在0～0.2 g·L-1的濃度范圍內(nèi)，無機(jī)磷吸光度(A)與NaH2PO4濃度線性良好(Fig 2)，且覆蓋了整個(gè)待測(cè)樣本的濃度范圍。

Fig 2 Standard curve of inorganic phosphate concentration

2.5.2 時(shí)間-ATP酶活性 結(jié)果顯示，PGB、GB、Ver誘導(dǎo)的P-gp ATP酶活性存在時(shí)間依賴性。隨著時(shí)間延長，各種藥物依賴的ATP水解釋放的無機(jī)磷量均增多，且無機(jī)磷釋放量與時(shí)間之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(Fig 3)。為達(dá)到最大靈敏度，選擇60 min作為藥物與P-gp膜作用時(shí)間，此時(shí)的吸光度均在Pi濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)。

Fig 3 Time-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

2.5.3 濃度-ATP酶活性 結(jié)果顯示，PGB、GB、Ver均能濃度依賴性地提高P-gp ATP酶活性(Fig 4)。Ver誘導(dǎo)的P-gp ATP酶活性明顯高于PGB和GB。在30 μmol·L-1時(shí)，GB誘導(dǎo)的P-gp ATP酶活性略高于PGB；而當(dāng)濃度增至150 μmol·L-1及以上時(shí)，PGB誘導(dǎo)的P-gpATP酶活性明顯高于GB。

3種藥物濃度達(dá)到300 μmol·L-1時(shí)，藥物誘導(dǎo)的P-gp ATP酶活性趨于平穩(wěn)。

根據(jù)米氏方程，以1/V對(duì)1/C作圖計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax、Km結(jié)果見Tab 6。 PGB的Km值小于GB，提示PGB與P-gp具有更高的親和力，這與分子對(duì)接的結(jié)合力預(yù)測(cè)結(jié)果(PGB > GB)較為吻合。若用Vmax/Km表示藥物與P-gp親和力，其順序亦是Ver (1.48)>PGB (0.22)>GB (0.06)。

Fig 4 Concentration-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

Tab 6 Estimated kinetic parameters for substrate-induced P-gp ATPase activity by three drugs

DrugsVmax/μmol·g-1·min-1Km/μmol·L-1Vmax/Km/min-1×10-3PGB52.08237.750.22GB53.76841.240.06Ver52.6435.481.48

3 討論

PGB是一種兼具PAF受體拮抗和鈣離子拮抗作用的新型GB前體藥物，本研究證實(shí)了PGB具有較優(yōu)的腦靶向性，其以治療有效性(TA)和靶向指數(shù)(DTI)評(píng)價(jià)的腦靶向效率達(dá)6.87和4.14。

藥物有無腦靶向性關(guān)鍵有兩點(diǎn)：一是藥物能跨越BBB大量入腦，二是入腦藥物不被外排出腦?？缒ぽ斎胍蕾囉谒幬飳?duì)BBB的通透性，BBB通透性通常取決于藥物本身的相對(duì)分子量、脂溶性以及特定的載體或受體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等。BBB上存在的P-gp外排泵，能將許多脂溶性好、易透過BBB的藥物外排出腦組織，所以減少輸出需降低P-gp的外排泵效能。

正辛醇-水體系的分配系數(shù)是預(yù)測(cè)藥物透膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的重要指標(biāo)。本研究通過搖瓶法結(jié)合HPLC測(cè)得PGB的logP數(shù)值(1.03)高于GB (0.61)，這說明將GB改造為PGB后脂溶性增強(qiáng)，更易于跨越BBB到達(dá)腦部，使腦內(nèi)可供降解為GB的PGB量上升。這一推測(cè)在尾靜脈注射PGB后GB腦內(nèi)濃度檢測(cè)(Tab 1)中得到了較好地證實(shí)。

P-gp 對(duì)藥物外排作用具有競(jìng)爭(zhēng)性和ATP依賴性，本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了分子對(duì)接軟件預(yù)測(cè)PGB、GB與P-gp的結(jié)合力，以此分析它們被P-gp外排的優(yōu)先性；研究PGB、GB對(duì)人P-gpATP 酶活性的影響，以此分析它們對(duì)P-gp外排功能的抑制作用。分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果提示，PGB與P-gp的結(jié)合力高于GB； PGB、GB對(duì)人P-gp膜 ATP酶活的測(cè)定結(jié)果表明：二者均能提高P-gp ATP酶活，阻斷P-gp介導(dǎo)的其它藥物外排，但PGB比GB具有更高的親和力，即PGB對(duì)P-gp的外排抑制作用更強(qiáng)，上述結(jié)果表明，當(dāng)腦內(nèi)同時(shí)存在PGB及PGB降解的GB時(shí)，PGB由于親和力強(qiáng)易被外排出腦，從而有效減弱或阻斷P-gp對(duì)GB的外排，最終使GB的腦內(nèi)濃度升高，在一定程度上增強(qiáng)了GB的腦靶向性。

綜上所述，PGB的腦靶向作用主要得益于較高的脂溶性和對(duì)P-gp的強(qiáng)抑制作用。以上研究結(jié)果提示：增大藥物的脂溶性(logP)及藥物與P-gp 親和力可在一定程度上實(shí)現(xiàn)腦靶向給藥，這對(duì)于腦靶向前藥設(shè)計(jì)提供一種新的設(shè)計(jì)策略，即可以借助計(jì)算化學(xué)的logP 計(jì)算和分子對(duì)接的P-gp親和力預(yù)測(cè)來設(shè)計(jì)篩選腦靶向前藥。

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On Brain targeting research of ginkgolide B prodrug

ZHU Shi-jing1, YUAN Yuan1,2, YIN Hua-yang1, HUI Ai-ling1, ZHOU An3, PAN Jian1

(1.InstituteofNaturalMedicine,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009，China; 2.ShenyangNormalUniversityCollegeofGrainScienceandTechnology,Shenyang110034,China; 3.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofChineseMedicine,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the brain targeting of ginkgolide B prodrug (PGB) and its mechanism. Methods The liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was applied to investigate the pharmacokinetics of PGB in rat brain tissue after intravenous injection of PGB. Also the brain targeting was evaluated on the basis of the pharmacokinetic parameter of PGB. The incomplete cerebral ischemia model was induced in mouse, the effect of PGB on cerebral capillary permeability was observed by Evans blue method. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the partition coefficients (logP) of PGB in octanol-water system. PGB and P-glycoprotein (P-gp) was docked by using Molegro Virtual Docker (MVD) software to predict its binding abilities with P-gp. The interaction of PGB with ATPase activity of human P-gp membrane was estimated by measuring inorganic phosphate liberation. Results The brain targeting of PGB was evaluated by treatment effective (TA) and drug targeting index (DTI), the calculated value were 6.87 and 4.14 respectively. Preventive medication of PGB could significantly decrease cerebral capillary permeability (P<0.05). The lipo-hydropartition coefficient of PGB was higher than that of GB, their logP data were 1.03 and 0.61 respectively. PGB displayed the stronger binding affinity with P-gp than GB according to the molecular docking calculations, their MolDock Score toward P-gp were -143.36 and -116.40KJ·mol-1respectively. ATP-hydrolisis showed that PGB increased ATPase activity with aKmof approximately 237.75 μmol·L-1, however GB with aKmof approximately 841.24 μmol·L-1. PGB might interact with P-gp with a higher affinity and exhibit more effect than GB. Conclusion PGB is characterized by its brain targeting. Higher liposolubility of PGB results in good blood-brain permeability, which is advantageous to its brain targeting. Besides, PGB can effectively inhibit the efflux effect of P-gp to GB because of its increased P-gp ATPase activity.

ginkgolide B; prodrug; brain targeting; cerebral ischemia; lipo-hydropartition coefficient; P-glycoprotein; ATPase activity

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.002.html

2014-11-22,

2015-01-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 21302037)；安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No 11010401025)

朱世璟(1989-)，女，碩士生，研究方向：天然藥物開發(fā)，Tel：0551-62901862，E-mail：970964309@qq.com； 惠愛玲(1980-)，女，博士，副研究員，研究方向：天然藥物開發(fā)，Tel：0551-62901862，E-mail：haling@mail.ustc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.021

A

1001-1978(2015)04-0542-08

R-332；R284.1；R322.81；R743.31；R977.3；R977.6