戊四唑急性癲癇模型海馬病理組織的變化

劉小虎,向紹杰,齊 越, 李 淼,李心培,孟 莉,陳 賀,賈 冬

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院，藥理學(xué)教研室, 遼寧 沈陽 110034; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 遼寧 沈陽 110032)

戊四唑急性癲癇模型海馬病理組織的變化

劉小虎1,向紹杰1,齊 越1, 李 淼1,李心培1,孟 莉1,陳 賀1,賈 冬2

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院，藥理學(xué)教研室, 遼寧 沈陽 110034; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 遼寧 沈陽 110032)

目的 觀察大鼠戊四唑急性癲癇模型造模后不同時間海馬神經(jīng)元損傷程度的變化。方法 大鼠腹腔注射10 g·L-1(64 mg·kg-1)戊四唑1次，誘發(fā)大鼠急性癲癇發(fā)作，分別于注射戊四唑后24、72、120、144 h將大鼠麻醉，灌流取腦，采用尼氏染色及免疫組化染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度。結(jié)果 與空白對照組相比，腹腔注射戊四唑后海馬神經(jīng)元損傷程度隨著時間的延長逐漸加重。結(jié)論 戊四唑急性致癇模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷的最大差異出現(xiàn)在腹腔注射戊四唑后120 h附近，可以將其作為藥效學(xué)研究的海馬組織取材時間。

戊四唑；尼氏染色；caspase-3；AIF；癲癇；大鼠

癲癇，俗稱“羊角風(fēng)”或“羊癲風(fēng)”，是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病。在眾多癲癇模型中，戊四唑可使致癇動物產(chǎn)生與人類極為相似的行為及神經(jīng)病理學(xué)改變，且戊四唑本身無特殊的神經(jīng)毒性作用，致癇不伴有神經(jīng)元壞死，如果致癇動物出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，可明確判斷是癲癇發(fā)作本身所致，使得結(jié)果分析更直觀、簡單，是一種研究癲癇發(fā)作與神經(jīng)損傷關(guān)系的較理想造模藥物[1]。雖然戊四唑誘發(fā)大鼠急性癲癇模型已經(jīng)十分成熟，但癲癇急性發(fā)作后對海馬神經(jīng)元的損傷隨時間的變化情況仍不明確，本研究在戊四唑誘發(fā)大鼠急性癲癇后于不同時間點將大鼠處死，對大鼠腦組織切片進(jìn)行尼氏染色及免疫組織化學(xué)染色，考察戊四唑誘發(fā)大鼠急性癲癇后在不同時間點海馬區(qū)的損傷程度，以確定在中藥藥效學(xué)研究中戊四唑誘發(fā)大鼠急性癲癇模型病理取材的最佳時間。

1 材料

1.1 藥品和試劑戊四唑，Sigma，批號：SLBF5034V。水合氯醛，北京市旭東化工廠，批號：20000530。多聚甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20091203。甲苯胺藍(lán)，SOLARBIO，批號：528A027。caspase-3，博士德生物，批號：BA111。AIF，博士德生物，批號：83410P365。DAB顯色試劑盒，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：1403030031。TMS-P超敏試劑盒，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：1312029706。無水乙醇，沈陽市新化試劑廠，批號20140428。二甲苯，沈陽市新化試劑廠，批號：20140106。枸櫞酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20130307。枸櫞酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20121009。磷酸二氫鈉，沈陽試劑三廠，批號：0601。磷酸氫二鉀，沈陽試劑一廠，批號：850901。氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20130909。

1.2 動物Wistar大鼠 46 只，♀♂各半，體質(zhì)量180～200 g，SPF級，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.3 儀器光電顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司，BX53型。電熱恒溫培養(yǎng)箱：廈門醫(yī)療電子儀器廠，JKDP2型?？酒瑱C：陽光神琦醫(yī)用科技有限公司，YG-280型。

2 方法

2.1 癲癇急性模型的建立及腦標(biāo)本制備[2-3]從46 只Wistar大鼠中按體重隨機抽取6只為空白對照組，空白對照組與144 h組同時麻醉，灌流取腦。其余40 只大鼠全部一次腹腔注射10 g·L-1戊四唑(64 mg·kg-1)。剔除因強直發(fā)作死亡的動物以及30 min內(nèi)癲癇強度未達(dá)到 Racine[4]5 級發(fā)作的動物，在剩余的大鼠中隨機抽取24 只，并按體重隨機分為4 組，分別為24 h組、72 h組、120 h組、144 h組，每組6 只。分別于注射戊四唑后24、72、120、144 h相應(yīng)組別大鼠用100 g·L-1水合氯醛 (10 ml·kg-1)深度麻醉，仰臥固定于解剖板上，在劍突下開胸，暴露心臟，用輸液針從心尖部插入左心室，在右心耳處剪口放血，先用200 ml生理鹽水快速灌注，然后減慢灌注速度直到從右心耳處流出無色液體，接著用溶于0.1 mol PBS的40 g·L-1多聚甲醛(pH 7.4)約150 ml繼續(xù)灌注固定。灌注完后斷頭取腦，然后放入40 g·L-1多聚甲醛，4 ℃固定72 h。將組織塊脫水至蠟23 h,然后石蠟包埋，在石蠟切片機上連續(xù)冠狀切片，厚度5 μm,切片放入40℃的蒸餾水中展開，然后用涂布100 g·L-1多聚賴氨酸的清潔載玻片撈出，晾干后46 ℃烘烤2 h備用。

2.2 尼氏染色方法[5-6]常規(guī)脫蠟至水后將切片浸入10 g·L-1甲苯胺藍(lán)溶液染色6 min,蒸餾水浸 5 min去除浮色,依次放入700 ml·L-1乙醇2 min, 950 ml·L-1乙醇5 min,無水乙醇浸泡3 min;然后用透明劑(二甲苯)透明2次,每次5 min,中性樹膠封片。每只大鼠隨機選擇2 張經(jīng)尼氏染色的大腦切片進(jìn)行觀察[7]。將切片置于200 倍顯微鏡下，觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的染色情況，于400 倍鏡下對各組大鼠腦片海馬CA1相同部位進(jìn)行神經(jīng)元計數(shù)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色[8-9]石蠟切片嚴(yán)格按照DBA試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色操作，觀察海馬區(qū)的病理變化，并使用Image J軟件對經(jīng)免疫組化染色的大腦切片海馬區(qū)200 倍放大圖片進(jìn)行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷尼氏染色結(jié)果由Fig 1可見空白對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的尼氏小體，急性癲癇造模后24、72、120、144 h大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元逐漸丟失，細(xì)胞排列疏松部分神經(jīng)元胞體皺縮，核固縮，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體減少，海馬神經(jīng)元損傷情況隨著時間延長逐漸加重，但細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示造模后120 h組的細(xì)胞個數(shù)和144 h組細(xì)胞個數(shù)差異未見顯著性(Tab 1)。

GroupCellnumberControl99.58±12.22PTZ24h87.00±10.37*PTZ72h80.67±9.25*PTZ120h69.25±9.60*PTZ144h71.50±12.18*

*P<0.05vscontrol group.Cell number：F=15.91

3.2 大鼠神經(jīng)元損傷免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由Fig 2、3可見，大鼠注射戊四唑后海馬CA1、CA3及皮層caspase-3和AIF蛋白陽性表達(dá)較空白組明顯，且隨著時間的延長陽性細(xì)胞染色逐漸加深。由表2可得出，與空白對照組相比,造模后120 h caspase-3和AIF的陽性細(xì)胞蛋白表達(dá)灰度值差異最明顯，P<0.05(Tab 2)。

GroupAveragerelativegrayofcaspase-3expressionAveragerelativegrayofAIFexpressioncontrol154.81±16.06173.09±9.57PTZ24h131.65±16.81*158.34±6.33*PTZ72h128.35±15.14*151.81±8.62*PTZ120h114.06±10.93*127.69±6.30*PTZ144h114.95±2.72*130.63±5.92*

*P<0.05vscontrol group. caspase-3：F=64.28;AIF：F=87.21

4 討論

神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)含有較發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、微絲、神經(jīng)絲和微管以及高爾基復(fù)合體等，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常呈現(xiàn)規(guī)則的平行排列，游離核糖體分布于其間，在光鏡下呈嗜堿性顆粒或小塊，稱尼氏體。尼氏體染色后呈塊狀(形如虎斑)或顆粒狀，核周圍尼氏體顆粒較大，近邊緣處較小而細(xì)長。在神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因尼氏體消失，胞質(zhì)著色淺，胞體腫脹，細(xì)胞由多極形狀變?yōu)閳A形，因此，根據(jù)神經(jīng)細(xì)胞形狀和數(shù)量差異，可判別神經(jīng)細(xì)胞損傷程度[10]。本研究中，大鼠戊四唑急性癲癇模型造模后120 h以內(nèi)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞隨著時間的延長損傷加重，模型組胞質(zhì)染色逐漸變淺，細(xì)胞排列混亂，稀疏，細(xì)胞核固縮變小。

Fig 1 Nissl staining of CA1 regions

Fewer neurons were in PTZ.24h, PTZ.72h, PTZ.120h and PTZ.144h groups compared with control group.

Fig 2 Caspase-3 activity in hippocampus of rats(×200)

Fig 3 AIF activity in hippocampus of rats(×200)

caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞殺傷機制的重要組成部分。caspase-3[11]最主要的底物是多聚 (ADP-核糖) 聚合酶(PARP)，該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡啟動時，116 ku 的PARP在Asp216-Gly217 之間被Caspase-3剪切成31 ku和85 ku兩個片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡[12]。caspase-3陽性表達(dá)為胞質(zhì)染色，由試驗結(jié)果可以看出戊四唑急性癲癇模型造模后120 h以內(nèi)海馬錐體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色隨著時間的延長逐漸加深，表明caspase-3蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞損傷加重。

凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)[13]是一種具有凋亡誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)，定位于線粒體的膜間隙。細(xì)胞受到凋亡刺激時，AIF分子從線粒體釋放到胞質(zhì)，然后再易位到核，與染色體 DNA結(jié)合，使染色體核周邊凝集和DNA 斷裂成約50 ku 的大片段。AIF具有凋亡誘導(dǎo)活性和氧化還原酶活性，但二者的作用是脫偶聯(lián)的。AIF在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起雙重作用，一方面充當(dāng)細(xì)胞凋亡的起始因子，另一方面又是細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)因子。AIF正常情況下位于線粒體中，能清除細(xì)胞內(nèi)的自由基而阻止凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，AIF首先從線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，然后再轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。免疫組化中，AIF陽性細(xì)胞核呈棕黃色，由試驗結(jié)果可以看出戊四唑急性癲癇模型造模后120 h以內(nèi)海馬錐體細(xì)胞核染色隨著時間的延長逐漸加深，表明AIF蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞損傷加重。

試驗結(jié)果表明，大鼠戊四唑急性癲癇模型造模后120 h海馬錐體細(xì)胞損傷最嚴(yán)重，與空白對照組差異最明顯，為藥效學(xué)研究的最佳取材時間。

[1] 高學(xué)杰.促紅細(xì)胞生成素對戊四氮致癇幼鼠腦保護(hù)作用研究[D].福建醫(yī)科大學(xué),2010.

[1] Gao X J.A study of neuroprotective effects of erythropoietin on the rats with epilepsy induced by Pentylenetetrazole[D].FujianMedicalUniversity, 2010.

[2] 王守權(quán),隋鴻錦,宮 瑾,等.戊四氮急性癲癇模型齒狀回分子層突觸的可塑性變化[J].解剖學(xué)雜志,2004,27(3):288-90.

[2] Wang S Q,Sui H J, Gong J, et al. Synaptic plasticity in molecular layer of dentate gyrus after acute epilepsy induced by pentetrazole in rats[J].ChinJAant, 2004,27(3):288-90.

[3] 王 玢,遲華基,袁芳曜,等.中藥復(fù)方對戊四氮致癇大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3表達(dá)的影響[J].山東教育學(xué)院學(xué)報,2010,142(6):39-41.

[3] Wang F,Chi H J,Yuan F Y,et al.Effect of Chinese medicine compound on the expression of caspase-3 in hippocampus of epileptic rats induced by pentatrazole[J].JShandongEducatInstitute, 2010,142(6):39-41.

[4] Racine R J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. Ⅱ. Motor Seizure[J].ElectroencephalogrClinNeurophysiol, 1972,32(3):281-94.

[5] Shibeeb O,Wood J P,Casson R J, Chidlow G. Effects of a conventional photocoagulator and a 3-ns pulse laser on preconditioning responses and retinal ganglion cell survival after optic nerve crush [J].ExperimentalEyeRes,2014,127:77-90.

[6] Dhaher R,Damisah E C, Wang H,et al. 5-Aminovaleric acid suppresses the development of severe seizures in the methionine sulfoximine model of mesial temporal lobe epilepsy [J].NeurobiolDis,2014,67:18-23.

[7] 張 瑋,韓 寧,胡金鳳,等.化合物IMM-H004對大鼠急性全腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2013,29(12):1654-9.

[7] Zhang W, Han N, Hu J F,et al. Neuroprotective effect of compound IMM-H004 against transient global brain ischemia/reperfusion in rat[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(12):1654-9.

[8] 馮建利,姚 博,閆 鵬,等.大鼠局灶性腦缺血/再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子的表達(dá)及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志,2007,27(10):1955-7.

[8] Feng J L,Yao B, Yan P, et al. The expression of apoptosis inducing factor after focal cerebral ischemia and reperfusion in rats and its relation to nerve cell apoptosis[J].ChinJGerontol,2007,27(10):1955-7.

[9] 李巧云,張海華,游仁芳.Caspase-3表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的影響[J].南昌大學(xué)學(xué)報,2013,53(10):11-4.

[9] Li Q Y,Zhang H H, You R F. The effects of caspase-3 the expression on neuronal apoptosis[J].JNanchangUnivMedSci,2007,53(10):1955-7.

[10]顧 兵,金建波,李華南,等.神經(jīng)組織染色方法的研究概況[J].中國藥理學(xué)通報,2011,27(10):1472-5.

[10]Gu B,Jin J B,Li H N,et al.Overview of nervous tissue staining method[J].ChinPharmacolBull, 2011,27(10):1472-5.

[11]Kalonia H, Kumar A. Suppressing inflammatory cascade by cyclo-oxygenase inhibitors attenuates quinolinic acid induced Huntington′s disease-like alterations in rats [J].LifeSci,2011, 88(17-18):784-91.

[12] 王海燕,王來栓.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊,2003,23(5):491-2.

[12] Wang H Y,Wang L S.Advances in apoptosis pathway[J].ForeignMedSciSectPathophysiolClinMed, 2003,23(5):491-2.

[13] Fleisch V C, Leighton P A, Wang H， et al. Targeted mutation of the gene encoding prion protein in zebrafish reveals a conserved role in neuron excitability [J].NeurobiolDis,2013, 55: 11-25.

[14] 王昌正,曹 誠,馬清鈞,等.凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)對細(xì)胞凋亡的調(diào)控[J].生命的化學(xué),2005,25(6):454-6.

[14] Wang C Z, Cao C, Ma Q J, et al. The regulation of apoptosis by apoptosis-inducing factor[J].ChemLife,2005,25(6):454-6.

[15] 張 軍,胡大海.AIF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2008,5(1):87-90.

[15] Zhang J, Hu D H.AIF in apoptosis induction[J].JMedMolBiol, 2008,5(1):87-90.

Histopathological changes of hippocampus after acute epilepsy induced by pentylenetetrazole in rats

LIU Xiao-hu1,XIANG Shao-jie1, QI Yue1, LI Miao1,LI Xin-pei1,MENG Li1,CHEN He1, JIA Dong2

(1.LiaoningProvinceChineseMedicineResearchInstitute,Shenyang110034,China; 2.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicineShenyang110032,China)

Aim To observe histopathological changes of hippocampus after acute epilepsy induced by penty-lenetetrazole (PTZ) in rats.Methods Five groups as control group，PTZ-induced 24 hours(h) group,PTZ-induced 72 hours group,PTZ-induced 120 hours group and PTZ-induced 144 hours group were designed. PTZ (64 mg·kg-1) was administered with a single intraperitoneal injection for generalized tonic-clonic seizures in the current experiment. Control and PTZ treated animals were sacrificed after specific time points. Brain was dissected out and then evaluated for neuropathological changes using Nissl staining and immunohistochemical technique. Results In this study PTZ-induced hippocampal neuron status apoptosis occurred at 24 hours and was sustained for 144 hours after status epilepticus. Whereas, activated caspase-3 and AIF appeared at 24 hours and were sustained for 144 hours after status epilepticus. Conclusion The results of this study show that the significant histopathological changes of hippocampus appear in the vicinity of 120 hours after intraperitoneal injection of pentylenetetrazole.

pentylenetetrazole; Nissl staining; caspase-3; AIF; epilepsy; rat

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.023.html

2014-12-29,

2015-01-30

國家科技部“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”專項課題(No 2012ZX09102201-005)

劉小虎(1985-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel：024-86803064，E-mail：haibianhandsome@126.com; 賈 冬(1963-)，男，研究員，主任中藥師，博士生導(dǎo)師, 研究方向：中藥復(fù)方配伍，新藥藥效學(xué)和安全性評價，通訊作者,Tel:024-31207389，E-mail:jiadg2003@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.015

A

1001-1978(2015)04-0514-05

R-332；R322.81；R363-332；R742.102.2