內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響*

李文憑， 崔曉棟， 侯寧寧， 張曉蕓， 劉建華， 張 靜， 成 敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院濰醫(yī)附院內(nèi)分泌科， 山東 濰坊 261053)

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內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響*

李文憑， 崔曉棟， 侯寧寧， 張曉蕓， 劉建華， 張 靜， 成 敏△

(濰坊醫(yī)學(xué)院濰醫(yī)附院內(nèi)分泌科， 山東 濰坊 261053)

目的：研究?jī)?nèi)向整流鉀通道阻斷劑氯化鋇(BaCl2)和氯化銫(CsCl)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)功能的影響。方法：利用密度梯度離心法體外分離大鼠骨髓單核細(xì)胞，并進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至3～5代時(shí)將細(xì)胞消化并等密度接種于六孔板中，待細(xì)胞融合至80%時(shí)用含2%胎牛血清的M199對(duì)其進(jìn)行同步化處理，然后分組進(jìn)行干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)主要分兩組：①BaCl2(100 μmol/L)及其無BaCl2的臺(tái)氏液組；②CsCl (1 mmol/L) 及其正常對(duì)照組。依照上述分組加入阻斷劑干預(yù)12 h后，檢測(cè)遷移、粘附功能及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、前列環(huán)素(PGI2)基因表達(dá)的變化。此外，收集各組處理3 d后的細(xì)胞上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清中SDF-1的含量。并進(jìn)一步通過信號(hào)通路阻斷劑預(yù)先干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，然后重復(fù)上述處理，并用熒光定量RT-PCR檢測(cè)SDF-1基因表達(dá)的變化來推測(cè)其作用機(jī)制。結(jié)果：與對(duì)照組相比，用BaCl2、CsCl處理后的EPCs遷移、粘附能力顯著增強(qiáng)，SDF-1、PGI2基因表達(dá)量增加；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，SDF-1分泌量較對(duì)照組明顯增加。Ba2+、Cs+促進(jìn)SDF-1分泌與eNOS信號(hào)通路有關(guān)；促進(jìn)PGI2的分泌與P38信號(hào)通路相關(guān)。結(jié)論：Ba2+、Cs+具有促進(jìn)EPCs遷移、粘附和分泌功能；SDF-1分泌增加的機(jī)制可能是通過eNOS信號(hào)通路來完成的，而PGI2與P38信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；內(nèi)向整流鉀通道；功能；分泌；大鼠

內(nèi)皮始祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells ，EPCs)是存在于骨髓和外周血中的一種未完全分化的多功能干細(xì)胞，具有分化為多種血管內(nèi)皮細(xì)胞的

潛能，并在促進(jìn)血管發(fā)生和疾病后血管損傷修復(fù)方面扮演著十分重要的角色[1]。研究表明，改善EPCs的功能對(duì)于修復(fù)心血管疾病過程中的血管損傷具有重要的意義[2]。而且有報(bào)道稱EPCs維持血管的完整性不僅僅通過分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，更多的是通過分泌一些酶、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等來發(fā)揮作用[3]。因此改變EPCs分泌等方面的功能對(duì)于血管性疾病來說具有關(guān)鍵性的作用。

Ba2+、Cs+是內(nèi)向整流鉀通道特異性通道阻斷劑，在一定程度上可影響內(nèi)向整流鉀通道的電流及其所在細(xì)胞的功能，并參與了廣泛的病理和生理過程?，F(xiàn)有研究證實(shí)，內(nèi)向整流鉀通道表達(dá)于EPCs膜表面，并可以被Ba2+、Cs+阻斷使得成血管數(shù)量減少，增值能力增強(qiáng)[4]。但是關(guān)于Ba2+、Cs+對(duì)EPCs分泌等方面的研究還不是很全面。故本實(shí)驗(yàn)通過利用鉀通道特異性的阻斷劑(Ba2+、Cs+)對(duì)EPCs的影響，不僅研究了其對(duì)EPCs功能的影響，并且著重討論了對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcell-derived factor-1, SDF-1)、前列環(huán)素(epoprostenol, PGI2)等分泌因子的影響及其作用機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)為鉀通道阻斷劑的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

SD大鼠(由解放軍第89醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供)；EGM-2完全培養(yǎng)基(Lonnza，美國(guó))；M199、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone, 美國(guó))；熒光定量相關(guān)試劑及基因相關(guān)引物(大連寶生物公司)；Trizol試劑(Invitrogen)；通道阻斷劑；PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；BaCl2、CsCl等化學(xué)試劑(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Boyden小室(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；SDF-1 ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQ5 )；倒置熒光顯微鏡(Leica, 德國(guó))；酶標(biāo)儀(Gene company limited, NO.20043, 美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離與培養(yǎng) 通過本實(shí)驗(yàn)組先前的方法[5]，誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠骨髓源性EPCs，步驟如下：頸椎脫臼法處死SD大鼠，將其浸泡在75%的乙醇中，15 min后取四肢長(zhǎng)骨，反復(fù)吹打獲取骨髓細(xì)胞。采用密度梯度離心法提取骨髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞，用EGM-2完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL雙染色和流式細(xì)胞儀的方法鑒定EPCs ，雙染色陽(yáng)性及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(vWF,CD31,VEGFR2)在80%以上的EPCs，為本實(shí)驗(yàn)所采用細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 待EPCs傳至3～5代時(shí)按2×105cells/ml的密度接種于六孔板，在細(xì)胞融合至90%左右時(shí)用含2%胎牛血清的M199進(jìn)行同步化12 h后，分組并設(shè)定對(duì)照組：(1)BaCl2組(無BaCl2臺(tái)式液對(duì)照組)；(2)CsCl組(無CsCl對(duì)照組)。其中BaCl2濃度為100 μmol/L、CsCl濃度為1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)所用的臺(tái)氏液組成成分包括：NaCl(140 mmol/L)、HEPES(15 mmol/L)、NaHCO3(35 mmol/L、Glucose(6 mmol/L)，將pH調(diào)至7.4。

1.2.3 細(xì)胞粘附功能實(shí)驗(yàn) 用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按2×104cells/ml的密度接種于12孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min。取出后用PBS清洗三遍，放于倒置顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞遷移功能實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶(0.25%)消化收集已處理過的EPCs并計(jì)數(shù)，Boyden小室的下室注滿培養(yǎng)液，中間放置直徑8 μm的濾膜，最后取相同密度細(xì)胞懸液100 μl置于上室，連接好后放于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12 h后取下濾膜并用棉簽擦拭未濾過的細(xì)胞，經(jīng)DAPI染色后放于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 熒光定量RT-PCR檢測(cè)SDF-1、PGI2EPCs被干預(yù)12 h后，按說明書提取總RNA，并溶于20 μl經(jīng)DEPC處理的去離子水中，取1 μl稀釋溶解測(cè)定RNA濃度，經(jīng)統(tǒng)一濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。SYBR Green熒光定量RT-PCR測(cè)定各組SDF-1、PGI2的Ct值。根據(jù)Ct值，依照公式2 -Ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參是GAPDH。實(shí)驗(yàn)所用引物由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成。

Tab. 1 Real-Time PCR primers

1.2.6 ELISA試劑盒檢測(cè)SDF-1 當(dāng)EPCs融合至80%時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞并接種于六孔板中，放在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿到70%時(shí)用2%M199同步化12 h，然后分組處理3 d，收集細(xì)胞上清。3 000 r/min的速度對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行離心處理20 min。依照SDF-1 ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行過檢測(cè)，并上機(jī)檢測(cè)其OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次。用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。在多組之間采用單因素方差分析，兩組之間使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鉀通道阻斷劑對(duì)EPCs遷移、粘附功能的影響

經(jīng)Ba2+、Cs+處理后的EPCs，貼壁能力明顯增強(qiáng)，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯高于各自對(duì)照組(57.57±7.16)vs(36.00±7.19)、(53.71±6.49)vs(45.29±5.91)(圖1)；細(xì)胞遷移數(shù)量也明顯多于各自對(duì)照組(97.80±11.41)vs(52.60±9.21)、(71.40±19.37)vs(35.40±10.52)，(P<0.05，圖2)。

Fig. 1 Effects of Ba2+and Cs+on the adhesion of EPCs EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

Fig. 2 Effects of Ba2+and Cs+on the migration of EPCs EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

2.2 鉀通道阻斷劑對(duì)SDF-1、PGI2基因表達(dá)的影響

經(jīng)過Ba2+、Cs+處理后的EPCs，SDF-1的基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的(1.92±0.52)、(3.89±1.03)倍；PGI2的基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的(2.55±0.08)、(7.29±1.09)倍(P<0.05，P<0.01，圖3)。

Fig. 3 Effects of Ba2+and Cs+on the gene expression of SDF-1and PGI2in EPCs s A: Group of Ba2+intervention; B: Group of Cs+intervention; SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothelial progenitor cells*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中SDF-1含量結(jié)果

將收集的細(xì)胞上清用ELISA試劑盒檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ba2+、Cs+干預(yù)后的EPCs上清中SDF-1含量較各自對(duì)照組顯著增多(1.23±0.07)vs(1.12±0.01)、(1.89±0.08)vs(1.09±0.08)(P<0.05，圖4)。

2.4 SDF-1、PGI2分泌增加的信號(hào)通路機(jī)制

預(yù)先加入信號(hào)通道阻斷劑干預(yù)2 h后，再用Ba2+、Cs+處理12 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，eNOS合成阻斷劑L-NAME干預(yù)后，SDF-1分泌量較對(duì)照組降低(0.84±0.17、0.70±0.18)倍；P38阻斷劑 SB203580處理EPCs后，PGI2分泌較對(duì)照組下降(0.44±0.08、0.52±0.07)倍。由此可推測(cè)，BaCl2和CsCl促進(jìn)SDF-1分泌的作用可能是通過eNOs信號(hào)通道來完成的；PGI2分泌增加主要與P38途徑相關(guān)(圖5)。

Fig. 4 Effects of Ba2+and Cs+on the release of SDF-1 from EPCs. EPCs was treated with Ba2+(100 μmol/L) or Cs+(1 mmol/L) for 72 h SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

Fig. 5 Effects of L-NAME and SB203580 on the gene expression of SDF-1 and PGI2in EPCs treated with Ba2+or Cs+A,C: Group of Ba2+intervention; B,D: Group of Cs+intervention; SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

3 討論

離子通道在人體內(nèi)參與調(diào)節(jié)許多生理活動(dòng)，是維持組織細(xì)胞正常生理功能的重要成員之一。離子通道在細(xì)胞、組織和器官中表達(dá)的改變不僅可以引起一些疾病的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)通過這種改變也可以達(dá)到治療疾病的目的。內(nèi)向整流鉀通道作為離子通道中最具特異性的離子通道之一，其參與完成了多個(gè)生理功能：包括維持膜電位的穩(wěn)定、促進(jìn)胃酸分泌、參與視網(wǎng)膜的修復(fù)等[6]。本實(shí)驗(yàn)主要通過Ba2+、Cs+阻斷EPCs內(nèi)向整流鉀通道的方法來研究EPCs分泌及多種功能的影響。

通過改善EPCs的功能為靶點(diǎn)來治療疾病已成為最近幾年研究的熱點(diǎn)。已有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，雌激素、促紅細(xì)胞生成素、他汀類藥物及體育鍛煉等可通過增加EPCs動(dòng)員或抑制EPCs細(xì)胞凋亡等途徑來增強(qiáng)EPCs的功能[7]。相比于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，EPCs能夠主動(dòng)歸巢到血管損傷部位，并參與組織的再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ba2+、Cs+能增強(qiáng)EPCs的遷移、粘附功能，對(duì)于血管的新生來說增強(qiáng)EPCs的遷移、粘附能力具有重要的意義。另有研究顯示SDF-1不僅有促進(jìn) EPCs的歸巢、參與血管新生、促進(jìn)骨折愈合和抗EPCs凋亡的作用，還與EPCs的粘附、遷移、增殖有關(guān)系[8]。但是本實(shí)驗(yàn)遷移、粘附功能增強(qiáng)的發(fā)生機(jī)制是否與SDF-1直接相關(guān)有待更深入的研究。

多項(xiàng)研究證實(shí)，EPCs具有分泌SDF-1、NO、PGI2、PAI-1、VEGF等細(xì)胞因子的功能，并在全身不同組織發(fā)揮著不同的生理作用[9]。本實(shí)驗(yàn)也通過基因、蛋白等方法在不同層面證實(shí)了內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑(Ba2+、Cs+)能促進(jìn)SDF-1、PGI2的分泌。本研究還發(fā)現(xiàn)，SDF-1分泌的增加主要與NO信號(hào)通路相關(guān)；PGI2的分泌主要依賴于P38途徑。另有研究顯示SDF-1促進(jìn)糖尿病大鼠EPCs向傷口部位遷移的機(jī)制也是通過NO途徑來完成的[10]。SDF-1是否與NO途徑有廣泛的聯(lián)系還需進(jìn)一步的研究。除此之外，PGI2分泌的增加也具有非常重要的意義，PGI2不僅可以維持脈管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，還可以抑制血小板的激活。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)，內(nèi)向整流型鉀離子通道阻斷，影響EPCs的功能，對(duì)新血管內(nèi)皮的損傷修復(fù)可能具有一定的積極作用。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)所研究濃度下Ba2+和Cs+能夠改善EPCs的遷移和粘附功能，并能促進(jìn)EPCs分泌SDF-1、PGI2。這可能對(duì)EPCs的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

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Effects of inward rectifier potassium channel blockers on EPCs function

LI Wen-ping, CUI Xiao-dong, HOU Ning-ning, ZHANG Xiao-yun, LIU Jian-hua, ZHANG Jing, CHENG Min△

(Deparmeut of Endocrine, the Affiliated Hospital, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

Objective: To investigate the effects of inward rectifier potassium channel blockers (BaCl2, CsCl) on the functions of endothelial progenitor cells (EPCs). Methods: Density gradient centrifugation-isolated rat bone marrow mononuclear cells were cultured in vitro. EPCs were harvested and seeded on six culture dish when cells grew to 3～5 passages. Before testing the EPCs were synchronized with M199, which contain 2% fetal calf serum. In the end, EPCs were treated with different intervention. The experiment mainly included two parts: ①BaCl2(100 μmol/L) and free BaCl2of Tyrodes solution; ②CsCl (1 mmol/L) and control. Cell pretreated with blockers above mentioned for 12 h, then the gene expression of stromal cell-derived factor-1(SDF-1), epoprotenol(PGI2) were assessed, beyond that the ability of adhesion, migration were assayed with different tests. In addition, the medium was collected when EPCs were treated for 3 days. The levels of SDF-1 were measured by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Going even further, EPCs were treated with the signal pathway blockers in advance, after repeat the above steps, in order to analyze the change of SDF-1 and then discuss its mechanism. Results: Compared with control group, BaCl2, CsCl could increase EPC adhesion and migration to same extent. Moreover, the gene expression of SDF-1, PGI2was significantly up-regualted and the production of SDF-1 increased evidently. Furthermore, the mechanism of SDF-1 secretion increasing mainly was associated with eNOS signaling pathways. Conclusion: Ba2+and Cs+play important roles in increasing EPCs functions, such as adhesion, migration and secretion. The secretion of SDF-1 and PGI2are mainly associated with eNOS and P38 signaling pathways respectively.【KEY WORDS】 endothelial progenitor cells; inward rectifier potassium channel; function; secretion;rat

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900290,31270993)；國(guó)家教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃” 資助項(xiàng)目(NCET-10-0922)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2011CQO30，ZR2014JL018)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(2011QZ024)

2015-01-12 【修回日期】2015-06-05

R335

A

1000-6834(2015)05-448-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.016

△【通訊作者】Tel： 0536-8462463； E-mail： mincheng@wfmc.edu.cn