膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1a反義寡核苷酸的設(shè)計及效果評價*

劉麗哲， 張 敏， 劉宜先， 崔 鑫， 胡玉燕， 李文斌△

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 2. 河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 石家莊 050017)

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膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1a反義寡核苷酸的設(shè)計及效果評價*

劉麗哲1， 張 敏1， 劉宜先2， 崔 鑫1， 胡玉燕1， 李文斌1△

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 2. 河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 石家莊 050017)

目的：應(yīng)用IDT公司的Antisense design software設(shè)計膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1a(GLT-1a)的反義寡核苷酸(AS-ODNs)，并對其進(jìn)行效果評價。方法：首先根據(jù)GLT-1a mRNA羧基末端特異序列，設(shè)計GLT-1a AS-ODNs；在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Western blot方法對設(shè)計的5條GLT-1a AS-ODNs抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的效果進(jìn)行評價。結(jié)果：序列為5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’的GLT-1a AS-ODNs可特異性地抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)，而對GLT-1b的表達(dá)無影響。該AS-ODNs對sham和頭孢曲松鈉(Cef)誘導(dǎo)的大鼠GLT-1a的表達(dá)上調(diào)的抑制效果類似，均>60%；對腦缺血預(yù)處理(CIP)誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的上調(diào)亦具有明顯的抑制作用，抑制效果>60%。結(jié)論：從設(shè)計的5條GLT-1a AS-ODNs中獲得了可特異性抑制GLT-la表達(dá)的反義寡核苷酸序列。

GLT-1a；反義寡核苷酸；頭孢曲松鈉；腦缺血預(yù)處理；海馬；大鼠

細(xì)胞外谷氨酸濃度的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glial glutamate transproter-1， GLT-1)在清除細(xì)胞外谷氨酸，使其維持低濃度方面發(fā)揮重要作用。因此對GLT-1的研究具有非常重要的理論和臨床意義。根據(jù)羧基端不同，可將GLT-1分為GLT-1a， GLT-1b， GLT-1c三種剪接變異體，其中在海馬GLT-1a占總GLT-1的90%左右[1]。隨著研究的深入，GLT-1a在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益受到重視，而研究GLT-1a在眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用機制一個重要策略是阻斷其表達(dá)和功能。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)GLT-1a的特異性阻斷劑。反義技術(shù)主要是利用Watson-Cricker 堿基配對原理，合成一段DNA或RNA片段，此片段與靶基因或mRNA具有互補序列，并能與特定的靶基因或mRNA形成雜交鏈，從而選擇性地沉默靶基因。1978年，Stephenson 和Zamenick 報道[2]，與Rous病毒核酸序列互補的13 mer反義寡聚脫氧核苷酸能夠抑制Rous病毒復(fù)制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核酸能夠抑制特定基因表達(dá)的概念。從80年代末至今，人們利用反義核酸技術(shù)，進(jìn)行了一系列的體外和體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的實驗。如有學(xué)者利用凋亡相關(guān)基因的反義寡核苷酸，研究該基因?qū)Π┙M織的凋亡作用[3,4]；也有學(xué)者設(shè)計疾病相關(guān)因子的反義寡核苷酸，從而研究該因子在疾病中的作用等等[5,6]。因此，本實驗針對GLT-1a mRNA羧基末端的特異序列進(jìn)行GLT-1a AS-ODNs設(shè)計，利用Western blot技術(shù)對所設(shè)計的AS-ODNs進(jìn)行篩選與效果評價，為研究GLT-1a在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供可靠的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Alpha Imager凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Alpha Inotech公司)，江灣Ⅰ型腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，EBA 12型高速低溫離心機(德國Hettich公司)，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份公司)，酶標(biāo)儀(奧地利TECAN)，水浴雙垂直電泳槽(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，307-6臺式牙鉆車(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

GLT1a AS-ODNs、Sense ODNs及Missense ODNs序列(本實驗室設(shè)計，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))；兔來源GLT-1a多克隆抗體和小鼠來源GLT-1b單克隆抗體(Thermo公司)；小鼠來源β-actin多克隆抗體IgG1(Santa Curz Biotechnology公司)；生物素標(biāo)記山羊抗兔和生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(KPL公司)；辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Zymed laboratories公司)；頭孢曲松鈉(廣州白云山制藥總廠)；DAB(北京中杉生物工程公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈣(北京化學(xué)試劑公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；腦室套管(深圳瑞沃德公司)；義齒基托樹脂(Ⅱ型)(上海醫(yī)療器械股份有限公司)；502膠(廣東愛必達(dá)膠粘劑有限公司)。

1.2 GLT-1a AS-ODNs的設(shè)計

根據(jù)大鼠GLT-1a mRNA羧基末端的特異序列(圖1)，應(yīng)用IDT公司的Antisense design software設(shè)計了5條GLT-1a AS-ODNs，5條GLT-1a AS-ODNs 依次簡稱為P1、P2、P3、P4、P5，其序列及對應(yīng)的靶點序列見表1。

Fig. 1 C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA

Tab. 1 Sequences of GLT-1a AS-ODNs(P1-P5) and their sequences of target point in rats

1.3 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠75只，體重280～320 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。在實驗室飼養(yǎng)1～2 d后，右側(cè)腦室置管以建立側(cè)腦室給藥通道，恢復(fù)5 d后隨機分為15組(n=5)。共包括以下3部分，各部分分組如下：

1.3.1 GLT-1a AS-ODNs對頭孢曲松鈉(ceftriaxone, Cef)誘導(dǎo)的GLT-1a蛋白表達(dá)上調(diào)的影響 (1)Cef+溶劑組：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共5次；于第1次注射Cef后36 h、72 h以及108 h右側(cè)腦室注射雙蒸水(DW)(GLT-1a AS-ODNs的溶劑)10 μl；(2)Cef+GLT-1a AS-ODNs組：進(jìn)一步分為P1～P5 5個亞組，分別給予相對應(yīng)的GLT-1a AS-ODNs雙蒸水溶液10 μl(18 nmol)，給予方法與(1)組雙蒸水的給予方法相同。其它處理同(1)組。通過Western blot檢測GLT-1a蛋白的表達(dá)數(shù)量。選擇抑制效果>60%的序列，進(jìn)一步觀察其對GLT-1b蛋白表達(dá)的影響，以確定其抑制GLT-1a蛋白表達(dá)的特異性。

1.3.2 GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef處理的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)抑制效果的比較

(1)Sham組：腹腔注射生理鹽水(NS，0.8 ml/kg)，每日1次，共6次，于每次腹腔注射后即刻側(cè)腦室注射DW 10 μl；(2)AS-ODNs組：以同樣方法于每次腹腔注射NS后即刻側(cè)腦室注射GLT-1a AS-ODNs的雙蒸水溶液10 μl(15 nmol)；(3)Cef+溶劑組：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共6次，于每次注射Cef后即刻側(cè)腦室注射DW 10 μl；(4)Cef+GLT-1a AS-ONDs: 于每次腹腔注射Cef后即刻側(cè)腦室注射GLT-1a AS-ODNs 的雙蒸水溶液10 μl(15 nmol)，每日1次，共6次。以上各組均于末次腹腔注射后2 d取大鼠海馬CA1區(qū)，應(yīng)用Western免疫印跡分析法檢測GLT-1a的表達(dá)。

1.3.3 GLT-1a AS-ODNs對腦缺血預(yù)處理 (cerebral ischemic preconditioning , CIP)誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的抑制作用 (1) Sham組：給大鼠進(jìn)行全腦缺血的sham手術(shù)。(2) CIP組：給大鼠CIP處理3 min，之后恢復(fù)再灌流。 (3) AS-ODNs+CIP組：于CIP前2 d開始給大鼠側(cè)腦室注射GLT-1a AS-ODNs溶液(15 μl，25 nmol)，后每間隔24 h注射1次，連續(xù)注射4次，其余處理同CIP組。同時，設(shè)GLT-1a的Sense ODNs (5’-TGCAGTGTTGAGGAAG AAC C-3’)和Missense ODNs (5’-GGTTCTTCGTCTACACTGCA-3’)對照組，分別側(cè)腦室注射相對應(yīng)的ODNs溶液。以上各組均于sham或CIP后2 d取海馬CA1區(qū)，應(yīng)用Western免疫印跡分析法檢測大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a的表達(dá)。

1.4 大鼠右側(cè)腦室埋管

給大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，將其固定于腦立體定位儀(江灣I型C立體定位儀)上，首先切開頭頂部皮膚，以充分暴露手術(shù)視野，然后分離骨膜，參照腦立體定位圖譜，確定Bregmar點并標(biāo)記，在此點右側(cè)旁開1.5 mm，向后0.8 mm處顱骨鉆孔，在此孔周圍避開骨縫選擇3個合適位置顱骨鉆孔，深度適宜且不鉆透，固定手表螺絲于3孔。將套管恢復(fù)至所鉆第1個孔處，從骨面向下進(jìn)3.8 mm，Ⅱ型義齒基托樹脂固定注射套管以備側(cè)腦室給藥。動物回籠納入單籠飼養(yǎng)，自由食水。

1.5 側(cè)腦室注射

誘導(dǎo)大鼠鉆入自制鼠袋中，露出鼻孔及套管外帽，待動物安靜后，在大鼠清醒安靜狀態(tài)下將內(nèi)芯旋出，將以PE50管連接微量注射器的消毒的內(nèi)針插入，同時緩慢將藥物推入(10 min)，留針10 min。注射結(jié)束后蓋好套管帽，動物回單籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6 CIP

全腦缺血3 min作為CIP。采用四血管閉塞法制造大鼠全腦缺血模型[7,8]。首先凝閉雙側(cè)椎動脈，具體操作如下：10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，枕骨后背側(cè)頸部作縱切口約1.5 cm大小，后分離兩側(cè)頸旁肌以暴露第一頸椎橫突，找到翼狀孔后將預(yù)熱的電灼針插入翼狀孔中，將雙側(cè)椎動脈電熱凝閉，使其永久閉塞。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，恢復(fù)2 d后行CIP。在乙醚吸入麻醉下，分離雙側(cè)頸總動脈，待動物清醒后夾閉雙側(cè)頸總動脈持續(xù)3 min后恢復(fù)雙側(cè)頸總動脈血流再灌。之后，慶大霉素沖洗、縫合傷口。在實驗過程中，應(yīng)用白熾燈照射以維持動物肛溫在37℃，到恢復(fù)活動為止。全腦缺血前后觀察大鼠翻正反射及瞳孔變化等以判斷是否成功誘導(dǎo)全腦缺血。Sham組僅分離、暴露雙側(cè)椎動脈和雙側(cè)頸總動脈，但不阻斷血流。

1.7 Western blot分析

各組大鼠在預(yù)定時間斷頭取腦，分離海馬CA1區(qū)，分析天平稱重后加入10倍體積的預(yù)冷裂解液，于冰浴下制成勻漿后靜置30 min，4℃12 000×g離心15 min，取上清分裝。提取蛋白后采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。然后取蛋白樣品50 μg ，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉后加入GLT-1a(兔抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KH137955)、GLT-1b(小鼠抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KL1273662)或β-Actin(小鼠抗大鼠，1∶1 500，lot no.:SC-4778)一抗，并于37℃孵育1 h，4℃靜置過夜，洗滌液 ( TBS， 0.05 % Tween 20) 洗滌3次，加入二抗(羊抗兔或羊抗小鼠，1∶2 000，Lot no.:090207或Lot no.:080219) 37℃孵育 1 h ，洗滌液 ( TBS，0.05 % Tween 20) 洗滌3次，加入三抗(辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，1∶1 000，Lot no.: 650578A)37℃孵育1 h，DAB顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GLT-1a AS-ODNs對Cef誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的影響

Cef+溶劑組大鼠海馬CA1區(qū)可見較強的GLT-1a表達(dá)(圖2)和一定程度的GLT-1b的表達(dá)(圖3)，與Cef+溶劑組相比，Cef+AS-ODNs(P2)組GLT-1a的表達(dá)明顯降低，抑制效果>60%，而其它各組GLT-1a的表達(dá)均無明顯變化(圖2)；Cef+AS-ODNs(P2)組GLT-1b的蛋白表達(dá)無明顯變化(圖3)。以上結(jié)果表明，所設(shè)計的GLT-1a的5條AS-ODNs(P1～P5)中，P2能夠有效抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白的表達(dá)，且其抑制效果具有特異性。因此，以下所有AS-ODNs均為該鏈。

2.2 GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)抑制效果比較

Sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見GLT-1a的基礎(chǔ)表達(dá)。與sham組相比，AS-ODNs組GLT-1a蛋白表達(dá)明顯下降，其表達(dá)量約占sham組的21%。Cef+溶劑組大鼠海馬CA1區(qū)可見較高的GLT-1a的表達(dá)。與Cef+溶劑組相比，Cef+AS-ODNs組GLT-1a蛋白表達(dá)明顯下降，其表達(dá)量約占Cef+AS-ODNs組的29%(圖4)。以上結(jié)果表明，GLT-1a AS-ODNs即可抑制正常大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a的基礎(chǔ)表達(dá)，又可抑制Cef引起的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的上調(diào)，且其抑制效果相似，均>60%。

2.3 GLT-1a AS-ODNs對CIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)上調(diào)的抑制作用

Sham組可見大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的GLT-1a基礎(chǔ)表達(dá)。與sham組相比，CIP后GLT-1a的表達(dá)明顯上調(diào)。側(cè)腦室注射GLT-1a AS-ODNs可抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表達(dá)上調(diào)及GLT-1a的基礎(chǔ)表達(dá)，表現(xiàn)為CIP+AS-ODNs組的GLT-1a蛋白表達(dá)與CIP組及sham組相比明顯下調(diào)，而側(cè)腦室注射GLT-1a Sense ODNs或Missense ODNs溶液則對CIP誘導(dǎo)的GLT-1a蛋白表達(dá)上調(diào)無明顯影響，表現(xiàn)為Sense ODNs對照組和Missense ODNs對照組的GLT-1a蛋白表達(dá)與CIP組相比無明顯變化 (圖5)。 以上結(jié)果表明，GLT-1a AS-ODNs可以有效地抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表達(dá)的上調(diào)。

3 討論

近年來對GLT-1及其剪接變異體的研究越來越深入。Dumont[9]等對肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)的患者和疾病的動物模型中GLT-1的活性及其剪接變異體GLT-1a和GLT-1b的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示隨著疾病的進(jìn)展，GLT-1的總體活性降低，GLT-1a在顳葉皮層表達(dá)顯著降低，而GLT-1b表達(dá)顯著增高；在腰髓，GLT-1a和GLT-1b表達(dá)均明顯升高。Amélie[10]等通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，研究TNF-α通過對肌萎縮側(cè)所硬化大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1a和GLT-1b表達(dá)及活性調(diào)節(jié)影響谷氨酸轉(zhuǎn)運。而Meabon[11]等學(xué)者對GLT-1的剪接變異體在胰腺的表達(dá)進(jìn)行了研究，胰島的β及α細(xì)胞都表達(dá)GLT-1a和GLT-1b，而外分泌導(dǎo)管區(qū)域主要表達(dá)GLT-1b。且發(fā)現(xiàn)在胰島谷氨酰胺合成酶與GLT-1a和GLT-1b共表達(dá)，表明在胰腺GLT-1參與谷氨酰胺合成。以上眾多研究提示GLT-1a和GLT-1b在同一處理因素下有著不同的調(diào)節(jié)，它們的作用值得進(jìn)一步研究。

反義寡核苷酸是一段短序列的單鏈DNA，體外化學(xué)合成后，在體內(nèi)按照堿基互補配對的原則，與其相對應(yīng)的靶點序列互補，形成雜交鏈以干擾基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪切以及翻譯，最終阻斷某種蛋白的合成。近年來反義技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種研究，例如有學(xué)者應(yīng)用P38 MAPK的反義寡核苷酸，研究其在肢體缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用[12]，還有學(xué)者應(yīng)用RyR的反義寡核苷酸研究Ryanodine受體對氣道平滑肌細(xì)胞增值及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響[13]。本實驗設(shè)計GLT-1a的反義寡核苷酸旨在為研究其在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦保護中的作用提供方便，而大鼠海馬CA1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域，因此整個實驗選用此區(qū)。而應(yīng)用反義寡核苷酸進(jìn)行研究必須設(shè)置嚴(yán)格的對照以便明確其特異的抑制效應(yīng)。本實驗在腦缺血預(yù)處理(CIP)動物模型的基礎(chǔ)上，設(shè)置CIP+AS-ODNs組的對照組CIP+Sense ODNs及CIP+ Missense ODNs，結(jié)果表明GLT-1a AS-ODNs能夠顯著抑制CIP誘導(dǎo)的GLT-1a蛋白的表達(dá)上調(diào)，而兩個對照組對CIP誘導(dǎo)的GLT-1a蛋白的表達(dá)上調(diào)無影響。從而證實了所設(shè)計的AS-ODNs對目的基因的特異性抑制作用。

2005年Rothstein[14]等研究發(fā)現(xiàn)Cef可以上調(diào)大鼠海馬組織GLT-1的表達(dá)，我室在2012[15]年就研究發(fā)現(xiàn)Cef對大鼠海馬組織GLT-1a蛋白表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，因此為了能夠增強對比，提高篩選效率，本研究中我們以腹腔注射Cef的動物模型為篩選平臺，使用Western blot免疫印跡方法，篩選能夠有效抑制GLT-1a蛋白表達(dá)的反義寡核苷酸鏈。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這5條鏈中，只有P2鏈能夠抑制目的基因的表達(dá)。說明通過計算機軟件可以幫助我們尋找反義寡核苷酸作用的靶點，但必須通過實驗來進(jìn)一步證實其抑制作用。隨后比較了GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLT-1a AS-ODNs對這兩種大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達(dá)均有明顯的抑制作用，且抑制效果相似都>60%，表明所用劑量的GLT-1a AS-ODNs沒有因為Cef上調(diào)了GLT-1a蛋白表達(dá)而影響其抑制效果。說明其抑制效果穩(wěn)定。最后本實驗將其應(yīng)用與腦缺血預(yù)處理大鼠，又明確了其對CIP誘導(dǎo)的GLT-1a表達(dá)上調(diào)的特異性抑制作用，進(jìn)一步證實了其對目的基因強有力的抑制作用，并為研究GLT-1a在CIP誘導(dǎo)的腦保護作用中的功能提供實驗依據(jù)。

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Designation and evaluation of antisense oligodeoxynucleotides targeted to glial glutamate transporter-1a

LIU Li-zhe1, ZHANG Min1, LIU Yi-xian2, CUI Xin1, HU Yu-yan1, LI Wen-bin1△

(1. Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, 2. Department of Physiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective: The present study was undertaken to design antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODNs) of glial glutamate transporter-1a (GLT-1a) and to evaluate the effectiveness of the designed AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Methods: Five sequences of GLT-1a AS-ODNs were designed according to the C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA using antisense design software of IDT Company. Western blot analysis was used to evaluate the inhibition effects of the five GLT-1a AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Results: The sequence of GLT-1a AS-ODNs with sequence of 5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’ could specifically inhibit the expression of GLT-1a in the hippocampal CA1 subfield of rats, while it had no effect on the expression of GLT-1b. This sequence showed similar inhibition on the expression of GLT-1a in sham and ceftriaxone (Cef) -treated rats. It could also significantly inhibit the cerebral ischemic preconditioning (CIP) -induced up-regulation in the expression of GLT-1a. The magnitude of the inhibition in sham, Cef- or CIP- treated rats was similar by more than 60%. Conclusion: From the designed five sequences of GLT-1a AS-ODNs, we obtained an effective sequence which can specifically inhibit the expression of GLT-1a.

GLT-1a; AS-ODNs; ceftriaxone; cerebral ischemic preconditioning; hippocampus; rat

國家自然科學(xué)基金資助項目(81271454)

2014-10-13

2015-02-12

R363

A

1000-6834(2015)03-238-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.012

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