高效液相色譜法測定知柏地黃丸中3種成分含量

毛愛麗

(河南省鶴壁市食品藥品檢驗所，河南 鶴壁 458030)

知柏地黃丸由熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓、知母、黃柏8味藥材組方[1]，具有滋陰降火之功效，臨床用于治療陰虛火旺、潮熱盜汗、口干咽痛、耳鳴遺精、小便短赤等證。其成分復(fù)雜，質(zhì)量較難控制，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有馬錢苷、丹皮酚的含量測定，而無君藥黃柏中鹽酸小檗堿的含量測定。為保證藥品質(zhì)量，本研究中建立了同時測定知柏地黃丸中馬錢苷、鹽酸小檗堿、丹皮酚3種成分含量的高效液相色譜法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司);UV－240型分光光度計(日本島津公司);pHS－3C型精密酸度計(上海電光器件廠);AE 240型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。知柏地黃丸(市售，用粉碎機(jī)粉碎處理);鹽酸小檗堿對照品(批號為110713－200911，按 C20H18ClNO4計，含量為 86.8%，使用前不需處理)，丹皮酚對照品(批號為110708－200506，使用前不需處理)，馬錢苷對照品(批號為 111640－201005，含量為 99.2%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h)，均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇、三乙胺均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTM(鉆石)C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相A為乙腈，B為磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和 0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含 0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào) pH 至 3.0][2]，梯度洗脫(0～10 min，A 為 12% ，B 為88%;10～11 min，12%A→40%A，88%B→60%B;11～25 min，A為 40%，B 為 60%;25～26 min，40%A→12%A，60%B→88%B;26～29 min，A 為 12%，B 為 88%);流速:1.000 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取對照品鹽酸小檗堿25.58 mg、丹皮酚49.96 mg、馬錢苷25.36 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密稱取知柏地黃丸1.000 g，精密加入甲醇50 mL，加熱回流15 min，置室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺黃柏、牡丹皮、山茱萸(制)的陰性樣品1.000 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:按擬訂色譜條件，分別取2.2項下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿、丹皮酚和馬錢苷對照品溶液色譜相同保留時間處均出現(xiàn)相同的色譜峰，陰性對照品溶液色譜中則無此峰(見圖1)。馬錢苷保留時間為7.387 min，鹽酸小檗堿為18.067 min，丹皮酚為21.273 min，峰分離度均大于3，理論板數(shù)均大于3 000。

線性關(guān)系考察:精密量取對照品貯備液，稀釋成含鹽酸小檗堿 為 1.776 3，2.664 4，4.440 7，8.881 4，13.322，17.762 7，26.644 1，35.525 4，44.41 μg/mL，丹皮酚為 19.984，29.976，39.968，59.952，79.936，99.92，119.904 μg/mL，馬錢苷為 1.006 2，2.012 4，3.018 6，5.031，10.062，15.093，20.124，30.186，40.248，50.31 μg/mL 的系列混合對照品溶液。分別各精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗:精密量取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果鹽酸小檗堿、丹皮酚、馬錢苷的 RSD均為0.10%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、丹皮酚、馬錢苷的 RSD分別為 0.20%，0.20%，0.30%(n=6)，表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，室溫下避光密封放置，分別于 0，2，4，8，12 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD 分別為 0.51% ，0.93% ，0.57%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗:稱取已知3種成分含量的樣品1.000 g，共9份;精密量取對照品貯備液10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取該對照品溶液3，5，10 mL各3份，加入9份樣品中，按擬訂方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

3 討論

按擬訂色譜條件，對3批樣品制備的供試品溶液進(jìn)行分析，將峰面積分別代入線性回歸方程，計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

取鹽酸小檗堿、丹皮酚對照品，分別用甲醇溶解，使用UV－240分光光度計，于200～400 nm波長處掃描，3個成分的最佳檢測波長分別為:鹽酸小檗堿266 nm和229 nm(A266nm＜A229nm)，丹皮酚275 nm和228 nm(A275nm＞A228nm)，馬錢苷236 nm。綜合考慮，選擇230 nm為測定波長。

稱取樣品適量，分別以甲醇－水(1∶1)、水、甲醇3種溶劑，采用回流及超聲2種方法，分別提取60，30，15 min。結(jié)果超聲處理不及回流效果好，前2種溶劑提取的樣品中，鹽酸小檗堿含量不及甲醇效果好，故采用甲醇提取。丹皮酚和鹽酸小檗堿在熱水中溶解，馬錢苷在水中極易溶解。經(jīng)水處理后，溶液黏稠度較大，不易濾過，且雜質(zhì)峰較多，影響分離效果，故放棄。丹皮酚在提取過程中，易隨蒸氣揮發(fā)，故在回流過程中應(yīng)注意密閉性，以減少成分損失。丹皮酚(4.248/4.125 mg/g)、馬錢苷(1.498/2.047 mg/g)2 種成分的測定，與《中國藥典(一部)》標(biāo)準(zhǔn)中單成分的測定相比，均能達(dá)到質(zhì)量控制的目的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:821－822，640－641.