酰胺及其酯類表面活性劑對礦物潤滑油基礎油生物降解性的影響

韋友亮，陳波水，王 九，張 楠，方建華，吳 江

（后勤工程學院 軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311）

酰胺及其酯類表面活性劑對礦物潤滑油基礎油生物降解性的影響

韋友亮，陳波水，王 九，張 楠，方建華，吳 江

（后勤工程學院 軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311）

以液體石蠟模擬礦物潤滑油基礎油，分別將脂肪酸酰胺、脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯（FEAP）表面活性劑加入液體石蠟中，通過測定生物降解指數(shù)（BDI），考察表面活性劑對液體石蠟生物降解性的影響；通過測定培養(yǎng)液的光密度和油水界面張力，考察表面活性劑促進液體石蠟生物降解的作用機制。實驗結(jié)果表明，3種酰胺及其酯類表面活性劑均可顯著提高液體石蠟的生物降解性，F(xiàn)EAP的效果最好，在液體石蠟中加入1.0%（w） FEAP時，可使液體石蠟的BDI由33.0%提高至71.9%；酰胺及其酯類表面活性劑能顯著降低培養(yǎng)液油水界面張力和加速微生物生長，從而促進液體石蠟的生物降解。

脂肪酸酰胺類表面活性劑；礦物潤滑油基礎油；生物降解；脂肪酸酰胺；脂肪酸二乙醇酰胺；脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯

礦物潤滑油是當前乃至今后較長時間內(nèi)應用最廣泛的潤滑劑品種之一。在使用過程中，不可避免地會通過泄露、飛濺、蒸發(fā)、包裝用品殘留、回收不當?shù)韧緩竭M入環(huán)境，因其生物降解性差［1］，嚴重污染土壤和水資源，破壞生態(tài)環(huán)境和生態(tài)平衡。目前，治理石油烴類污染采取的方法有石油烴稀釋、遷移等物理方法和萃取、化學氧化等化學方法，這些方法難將石油烴徹底降解，且易造成二次污染。生物修復方法具有安全、經(jīng)濟性強和無明顯二次污染等顯著優(yōu)點，越來越受到人們的關注。

環(huán)境微生物學的研究表明，某些含氮和/或磷等元素的化合物可加快微生物繁殖，增強其活性，促進難降解化合物的生物降解［2-4］。自然環(huán)境中，氮源和磷源經(jīng)常是烴類化合物生物降解的重要限制因素。鑒于此，在礦物潤滑油中設計添加含氮和/或磷等元素的表面活性化合物，可望有效改善其生物降解性，實現(xiàn)潤滑油污染環(huán)境的“主動”生物修復。陳波水課題組［5-9］率先開展研究，表明在礦物基礎油和礦物成品油中添加氨基酸、酰胺等含氮和/或含磷的化合物，可明顯改善潤滑油的生物降解性，并且還可有效改善潤滑油的相關使用性能。

本工作以液體石蠟模擬礦物潤滑油基礎油，研究了脂肪酸酰胺（FAA）、脂肪酸二乙醇酰胺（FDEA）、脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯（FEAP）3種酰胺及其酯類表面活性劑對液體石蠟生物降解性的影響。

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

油酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；液體石蠟：分析純，上海華靈康復器械廠；FAA，F(xiàn)DEA，F(xiàn)EAP：實驗室制備；實驗用水為去離子水，自制。

1.1.2 菌株

所選菌株分別為假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博德特式菌屬和戈登氏菌屬。4株菌種系從油污染土壤中富集培養(yǎng)、分離和鑒定，并被證實具有降解潤滑油的作用［10］。菌種用甘油冷凍保藏法于-70 ℃下保存，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）LB液體培養(yǎng)液：將胰蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g置于500 mL錐形瓶中，用5 mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0，用去離子水定容至300 mL，用121 ℃的蒸汽滅菌15 min。

2）無機鹽培養(yǎng)液：將NaCl 0.05 g，NH4NO30.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.05 g，CaCl20.25 g，KH2PO40.25 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g置于1 000 mL錐形瓶中，用去離子水定容至 500 mL，用121 ℃的蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 儀器

BS-1E型振蕩培養(yǎng)箱：金壇市富華儀器有限公司；L535-1型離心機：長沙湘儀儀器有限公司；HARKE-DWK型自動界面張力儀：北京哈科試驗儀器廠；TU-1950型紫外-可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 菌懸液的配制

采用濕重法配制菌懸液作為生物降解實驗的接種微生物。在LB平板上用反復平板劃線法分別將4株菌株復活，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，置于溫度（30±2）℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，再于轉(zhuǎn)速8 000 r/min下離心分離6 min，去上層清液，稱菌體濕重。用0.85%（w）無菌生理鹽水配制10%（w）菌懸液。量取單菌株菌懸液各2.5 mL，混合后組成混合菌懸液（10 mL）。

1.3 生物降解性的測定

以液體石蠟模擬礦物潤滑油基礎油，考察表面活性劑對生物降解液體石蠟的影響。在液體石蠟中分別加入1.0%（w）的FAA，F(xiàn)DEA，F(xiàn)EAP作為加表面活性劑的試樣。以加表面活性劑試樣、空白試樣（液體石蠟）和基準物（油酸）作為受試物，以混合菌懸液作為接種微生物。

采用生物降解性測定方法［11］測定各受試物的生物降解性。該方法以生物降解指數(shù)（BDI）（BDI定義為相同條件下受試物降解生成CO2的量與基準物降解生成CO2的量的比值）作為指標評定受試物的生物降解性。BDI值越大，生物降解性越好。實驗時間12 d，溫度（30±2） ℃。每隔2 d測定一次CO2的生成量，并計算各受試物CO2生成量的變化，一種受試物進行3次重復測定，取3次測定的平均值作為CO2的生成量的測定結(jié)果，由CO2生成量累計值計算BDI。

1.4 微生物生長變化及界面張力的測定

分別將FAA（0.002 5 g）、FDEA（0.002 5 g）、FEAP（0.002 5 g）與液體石蠟（0.25 g）、混合菌懸液（2.5 mL）加入到pH=7.0的500 mL無機鹽培養(yǎng)液中，置于溫度（30±2）℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d。

培養(yǎng)液培養(yǎng)過程中每隔2 d取樣一次（取樣150 mL），采用紫外-可見光分光光度計在600 nm 波長處測定培養(yǎng)液的光密度（D（600））；培養(yǎng)液經(jīng)轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心分離10 min后取上層清液，采用自動界面張力儀測定其油水界面張力［12］。每次測定結(jié)束后，將所取試樣倒回對應的錐形瓶，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑種類對液體石蠟生物降解性的影響

2.1.1 表面活性劑種類對CO2生成量的影響

表面活性劑種類對液體石蠟生物降解過程中CO2生成量的影響見圖1。由圖1可見，添加表面活性劑時，液體石蠟在生物降解過程中CO2生成量明顯增加；液體石蠟在生物降解過程中CO2生成量隨時間的變化曲線均呈現(xiàn)波浪型分布；添加FEAP時，液體石蠟在生物降解過程中CO2生成量最大。這是因為酰胺或其酯類表面活性劑提供了磷、氮營養(yǎng)物質(zhì)，促進了微生物的生長；液體石蠟是一種碳數(shù)分布在12～22且結(jié)構(gòu)組分較為復雜的混合物［13］，為降解菌提供了不同組分的碳源，另外由于微生物對石油烴類物質(zhì)的利用率與其結(jié)構(gòu)密切相關［14］，因此CO2生成量出現(xiàn)的兩個波峰是由于兩種結(jié)構(gòu)不同且含量較高的碳源被降解菌先后降解所致。

圖1 表面活性劑種類對液體石蠟生物降解過程中CO2生成量的影響Fig.1 Effects of surfactants on the CO2production（mCO2） in the biodegradation of liquid paraffi n.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；Fatty acid diethanol amide（FDEA）；Fatty acid amide（FAA） ；Fatty acid ethanol amide phosphate（FEAP）

2.1.2 表面活性劑種類對液體石蠟BDI的影響

表面活性劑種類對液體石蠟BDI的影響見圖2。由圖2可見，在實驗周期內(nèi)，加表面活性劑液體石蠟的BDI明顯大于未加表面活性劑的液體石蠟，這說明FAA，F(xiàn)DEA，F(xiàn)EAP 3種表面活性劑均可促進液體石蠟的生物降解。其原因可能是液體石蠟中的烴類與表面活性劑中的疏水基團相互作用，使油水界面張力降低，油水界面面積增大，微生物與液體石蠟中烴類的接觸機會增多，從而提高了生物降解率。在添加量同為1.0%（w）的情況下，3種酰胺及其酯類表面活性劑促進液體石蠟生物降解效果的差距較大，BDI依次為：FEAP 71.9%，F(xiàn)AA 68.3%，F(xiàn)DEA 56.0%。

圖2 表面活性劑種類對液體石蠟BDI的影響Fig.2 Effects of the surfactants on the biodegradation index（BDI） of liquid paraffi n.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA ；FEAP

研究結(jié)果表明，表面活性劑的生物降解性與其自身結(jié)構(gòu)有關，主要由疏水基團決定，并隨疏水基線性程度的增強而增加［15］。3種酰胺及其酯類表面活性劑結(jié)構(gòu)中均含有疏水基團酰胺基，在同等添加量下，F(xiàn)DEA結(jié)構(gòu)中酰胺基氫原子被醇烷基取代，使得疏水基的線性程度減弱，導致其生物降解性降低，可能影響微生物對其利用，所以促進液體石蠟的降解效果比FAA差。細菌表面總是帶負電，溶液中由于靜電力作用，陽離子易吸附到細菌表面，影響細菌的正常生理活動，從而對細菌生長造成一定程度的危害［16］。FEAP是陰離子表面活性劑，在溶液中電離為帶負電的離子，不易吸附于細菌表面，可能更利于生物降解；此外，相比于FAA 和FDEA，F(xiàn)EAP可同時提供磷和氮兩種營養(yǎng)物質(zhì)，可能使其更好地被微生物利用，故促進降解的效果最好。這也是加不同的表面活性劑時，液體石蠟在生物降解過程中CO2生成量不同的原因。

2.2 表面活性劑對生物降解的促進作用

2.2.1 改變油水界面張力

表面活性劑對培養(yǎng)液油水界面張力的影響見圖3。由圖3可見，加表面活性劑培養(yǎng)液的油水界面張力總體上低于未加表面活性劑的培養(yǎng)液。這表明3種酰胺及其酯類表面活性劑均能降低培養(yǎng)液的油水界面張力。

通過對烴類化合物乳化和假增溶作用，提高烴類化合物的生物可利用率［17］。微生物在生長過程中，為適應環(huán)境往往生成多種結(jié)構(gòu)形式的生物表面活性劑［18］，生物表面活性劑可通過分散和增溶兩種途徑提高有機物的生物可利用率［19］。由圖3可見，在第6 d，加表面活性劑培養(yǎng)液的油水界面張力下降明顯，這可能正是因為微生物生長進入穩(wěn)定期，產(chǎn)生了生物表面活性劑，進一步降低了油水界面張力，從而增大油水界面面積，增加微生物與較大油滴之間的直接接觸，提高了微生物對有機物的生物可利用率。

圖3 表面活性劑對培養(yǎng)液油水界面張力的影響Fig.3 Effects of surfactants on the oil-water interfacial tensions（F） of cultured broths.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA ；FEAP

2.2.2 促進微生物的生長

在降解烴類化合物的過程中，微生物數(shù)量對降解速率有很大影響，其增長率最快時期最有利于降解烴類化合物［20］。添加表面活性劑培養(yǎng)液的D（600）隨降解時間的變化見圖4。

圖 4 添加表面活性劑培養(yǎng)液的D（600）隨降解時間的變化Fig.4 Optical density（D（600）） of the cultured broths containing the surfactants vs. biodegradation duration.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA；FEAP

從圖4可見，未加表面活性劑培養(yǎng)液的D（600）隨降解時間的延長而增大，在第4 d進入對數(shù)生長期，至第6 d后趨于穩(wěn)定，進入靜止期；加表面活性劑培養(yǎng)液的D（600），隨降解時間的延長先增大后降低而后再增大，呈現(xiàn)波浪型變化，在第2 d就進入對數(shù)生長期，其原因是酰胺及其酯類表面活性劑含有的磷、氮營養(yǎng)物質(zhì)促進了微生物生長，但當營養(yǎng)物質(zhì)消耗不能滿足微生物生長時，微生物進入衰亡期，致使D（600）減小，微生物經(jīng)過調(diào)整其生長再次活躍并最終趨于穩(wěn)定，這與圖3中油水界面張力的變化規(guī)律相一致。

3 結(jié)論

1）液體石蠟中加入FAA，F(xiàn)DEA，F(xiàn)EAP，均可顯著促進液體石蠟的生物降解，F(xiàn)EAP的促進降解效果最好，其次為FAA，第3為FDEA。

2）在液體石蠟生物降解過程中，表面活性劑能有效降低油水界面張力，使微生物與烴類化合物接觸機會增多，促進微生物對烴類化合物的利用率。

3）在液體石蠟生物降解過程中，酰胺及其酯類表面活性劑為微生物生長提供必需的磷、氮元素，對微生物的生長和繁殖起到促進作用。

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（編輯 李治泉）

Effects of Fatty Amide Type Surfactants on Biodegradability of Mineral Lubricant Base

Wei Youliang，Chen Boshui，Wang Jiu，Zhang Nan，F(xiàn)ang Jianhua，Wu Jiang
（Department of Oil Application & Management Engineering，Logistical Engineering University，Chongqing 401311，China）

The effects of three fatty amide type surfactants，namely fatty acid amide，fatty acid diethanol amide and fatty acidic ethanol amide phosphate（FEAP），on the biodegradation of liquid paraffi n which was used as simulated mineral lubricant base were investigated by the determination of the biodegradation index（BDI）. The infl uences of the amide type surfactants on the biodegradation of liquid paraffin were researched through measuring the optical density and oil-water interfacial tension of the cultured broths by means of ultraviolet-visible spectrophotometer and interfacial tension instrument. The results indicated that the biodegradability of liquid paraffi n was markedly improved by adding the surfactants among which FEAP was the best. The biodegradability of liquid paraffin increased from 33.0% to 71.9% by the addition of 1.0%（w） FEAP. Through the addition of the amide type surfactants，the oil-water interfacial tensions of the cultured broths were decreased obviously and the growth of microbes was promoted，which could improve the biodegradation of liquid paraffi n.

fatty amide type surfactants；mineral lubricant base；biodegradation；fatty acid amide；fatty acid diethanol amide；fatty acid ethanol amide phosphate

1000 - 8144（2015）06 - 0748 - 05

TE 626.3

A

2014 - 12 - 22；［修改稿日期］ 2015 - 02 - 24。

韋友亮，男，湖北省黃岡市人，碩士生，電話 18523690127，電郵 18523690127@163.com。聯(lián)系人：陳波水，電話13883692917，電郵 boshuichen@163.com。

國家自然科學基金項目資助（50975282）。