β-TCP對比格犬下頜骨中巢蛋白家族基因表達的影響

趙 劍 安孫子 宜 光

(1.天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓病一科，天津300041;2.日本大學松戶齒學部生化學、分子生物學講座)

β-TCP對比格犬下頜骨中巢蛋白家族基因表達的影響

趙 劍1安孫子 宜 光2

(1.天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓病一科，天津300041;2.日本大學松戶齒學部生化學、分子生物學講座)

目的以比格犬下頜骨人造骨缺損為模型研究β-磷酸三鈣(β-TCP)對巢蛋白家族巢蛋白-1(nidogen-1)和巢蛋白-2(nidogen-2)基因表達的影響。方法在比格犬下頜骨前磨牙區(qū)制備的人造骨缺損中植入β-TCP，用RT-PCR法觀察植入后第4、7、14天時植入區(qū)活體組織樣本中nidogen-1和nidogen-2 mRNA的表達。結果與對照組相比，β-TCP組nidogen-1和nidogen-2第4天時mRNA電泳條帶增強，第7天的mRNA電泳條帶明顯增強，14天時無明顯變化。結論β-TCP對比格犬下頜骨中巢蛋白家族nidogen-1和nidogen-2的基因表達有促進作用。

β-磷酸三鈣;巢蛋白;基因表達;比格犬

巢蛋白(nidogen)是構成基底膜的重要細胞外基質蛋白，目前已發(fā)現nidogen-1和nidogen-2兩個巢蛋白家族成員，nidogen-1和nidogen-2在分布上有明顯不同，nidogen-1更多的存在于哺乳動物中，Nidogen在皮膚、肌肉、肺和神經系統(tǒng)等多個組織的基板的超分子組結構中發(fā)揮中心作用［1］。當發(fā)生細胞侵入和組織遷移引起細胞外基質轉化時，nidogen-1的蛋白水解可以觸發(fā)基底膜的重構。研究表明，Nidogen與細胞膜上的腫瘤內皮標志7(TEM-7)結合有促進血管生成和穩(wěn)定新生微血管的作用［2］。

作為一種生物降解材料，β-磷酸三鈣(β-TCP)因其良好的生物相容性和骨傳導性，被廣泛地應用于骨缺損修復。β-TCP結構中含有磷酸鈣基，當其植入活體缺損部位后，Ca、P離子能夠降解進入循環(huán)系統(tǒng)形成新骨［3－4］。隨著β-TCP合成技術的發(fā)展，學者們研究制備出力學性能優(yōu)良的多孔β-TCP陶瓷，并將β-TCP與具有成骨能力的多種細胞因子結合制備出具有良好骨誘導能力和成骨特性的β-TCP復合支架材料［5］，作者先前的研究表明β-TCP可以促進比格犬下頜骨中Ⅰ型膠原α1(Col1A1)、堿性磷酸酶(ALP)、轉化生長因子-β2(TGF-β2)等重要的成骨標志性蛋白的基因表達［6］，為研究β-TCP的成骨機制提供了實驗依據，但有關β-TCP與巢蛋白關系的研究尚無報道，本實驗以比格犬人造下頜骨缺損為模型，研究了β-TCP對巢蛋白家族nidogen-1和nidogen-2基因表達的影響，為從分子水平闡明β-TCP的骨誘導和骨形成機制提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物準備雄性馴化種比格犬3只由SLC公司提供，體重12～14千克，于日本大學松戶齒學部實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)級別:清潔級。

1.2 比格犬人工下頜骨缺損制備、β-TCP植入及樣本提取將3只比格犬單側下頜第二、三前磨牙共6個位點隨機分為β-TCP組和對照組。比格犬按1mg/kg的劑量，行靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，拔除第二、三前磨牙，自然愈合3個月后檢查術區(qū)無異常，局麻下以直徑4.5 mm，長8 mm的牙科種植鉆頭在原拔牙窩處制作人工骨缺損，對照組將粘膜縫合待創(chuàng)口自然愈合，實驗組植入純度大于99%的β-TCP-100(Taihe Chemicals Limited)后縫合粘膜。兩組均術后立即肌注慶大霉素60 mg，術后3天每日肌注慶大霉素6 mg/kg。術區(qū)每日擦拭消毒，常規(guī)護理。術后3天進軟食保護術區(qū)，3天后正常飲食。術后第4，7，14天時分別拆除縫線，剝離粘膜，用前述的牙科種植鉆頭取出創(chuàng)口內的活體組織。

1.3 RNA提取使用RNA提取套裝(RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit Isolation System，Qiagen)按照說明書提取總RNA。用核酸定量儀測定RNA樣本的濃度和吸光度(A)值，以A260/A280的比值來鑒定RNA樣本的純度。

1.4 RT-PCR法檢測nidogen-1和nidogen-2 mRNA表達使用GeneAmp RNA PCR Kit(Applied Biosystems，USA)，將2.0μg總RNA用于RT-PCR反應，使用狗nidogen-1、nidogen-2和GAPDH三種引物，引物序列見表1。擴增條件:94°C，5 min預變性，然后按以下進行35個循環(huán)的擴增:94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s。最后72°C，5 min延伸。將各組的擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠中電泳后，溴化乙錠染色，紫外透視儀下觀察結果、拍照、分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

β-TCP促進比格犬下頜骨中nidogen-1和nidogen-2的mRNA表達:RT-PCR擴增產物的凝膠電泳實驗表明，將β-TCP植入比格犬下頜骨人造骨缺損4、7天后，β-TCP組nidogen-1和nidogen-2的mRNA的電泳條帶較對照組均增強，其中第7天增強明顯，14天時nidogen-1和nidogen-2無明顯變化;作為標準對照的各組的GAPDH的mRNA電泳條帶未見明顯變化(圖1)。

3 討論

本研究以比格犬下頜骨人造骨缺損為模型，證明了β-TCP對Nidogen家族基因表達的促進作用。研究表明，Nidogen通過RGD序列結構(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)與細胞膜上的α3β1整合素受體結合可以調節(jié)細胞連接的穩(wěn)定性，提示材料植入后的骨替代過程中，β-TCP刺激Nidogen高表達，后者可能通過與α3β1整合素受體結合來提高參與成骨過程細胞連接的穩(wěn)定性，從而保證和促進細胞正常功能的行使，促進成骨過程［7］。

圖1 β-TCP對Beagle犬下頜骨中nidogen-1和nidogen-2 mRNA表達的影響

Nidogen作為細胞外基質，其在β-TCP刺激下的高表達可能增加與內皮細胞的黏附，從而刺激新生血管的生成，促進骨改建過程。另外，研究表明，Nidogen與細胞膜上的TEM-7結合有促進血管生成和穩(wěn)定新生微血管的作用，提示Nidogen可能通過這種機制來刺激血管生成從而促進成骨。

β-TCP是最早用作骨替代材料的鈣磷化合物之一，被廣泛應用于臨床并取得了良好的效果，然而，有關β-TCP的研究多數集中在β-TCP的結構、復合材料的研制以及植入后的臨床效果、體征的改善等［8］，從分子水平研究其促進骨形成和骨修復機制的報道尚不多見，本研究從基因水平探討了β-TCP對成骨相關基因的作用，證明了比格犬下頜骨中β-TCP對Nidogen家族基因表達的促進作用，為研究β-TCP的骨替代機制提供了新的實驗依據。

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［3］劉家祺，亓發(fā)芝.Beta-磷酸三鈣復合材料的研究進展［J］.中國美容醫(yī)學，2011，20(4):688－690.

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［5］龔立，陳際達，揭芳芳.β-TCP的研究進展及其在骨科中的應用［J］.河北化工，2006，29(11):54－57.

［6］Zhao J，Watanabe T，Bhawal UK，et al.Transcriptome analysis of β-TCP implanted in dog mandible［J］.Bone，2011，48:864－877.

［7］Hong C，Noboru K.A biodegradable porus composite scaffold of PGA/β-TCP for bone engineering［J］.Bone，2010，46(2):386－395.

［8］史定偉，謝幼專，湯亭亭，等.β-TCP植入人體骨缺損后的組織學觀察［J］.生物骨科材料與臨床研究，2008，5(3):8－10.

Impact of β-TCP on nidogen gene expression in Beagle dog mandible

Zhao Jian1Abiko Yoshimitsu2
(1.Dept.of Endodontology，Tianjin Stomatology Hospital，Tianjin 300041; 2.Dept.of Biochemistry and Molecular Biology，Nihon University School of Dentistry at Matsudo)

Objective:To investigate the effects of β-TCP on nidogen family nidogen-1 and nidogen-2 gene expression in artificial bone defects of Beagle dog mandible.Methods:β-TCP were implanted into the artificial osseous defects for 4，7，and 14 days，and RT-PCR was performed to determine the mRNA levels of nidogen-1 and nidogen-2.Results:The mRNA levels of both nidogen-1 and nidogen-2 were up-regulated by β-TCP on day 4，evidently increased on day 7，no change was observed on day 14.Conclusion:β-TCP stimulates nidogen gene expression in Beagle dog mandible.

β-TCP;nidogen;gene expression;Beagle dog

R781

A

1004-7115(2015)05-0498-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.005

2015-01-08)

趙劍(1982－)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事口腔內科學工作。