維生素D受體基因FokI多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關性研究

侯麗君 黃東輝 韓靜靜

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東泰安271000)

維生素D受體基因FokI多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關性研究

侯麗君 黃東輝 韓靜靜

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東泰安271000)

目的探討維生素D受體(VDR)基因FokI多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的關系。方法按1999年WHO糖尿病(DM)診斷及分型標準，選取無親緣關系的漢族2型糖尿病患者254例，分為單純2型糖尿病(DM)組、非增殖性視網(wǎng)膜病變(NPDR)組、增殖性視網(wǎng)膜病變(PDR)組，選取健康人群120例為對照組(NC)。采用PCR-RFLP方法確定受試者的VDR基因FokI基因型，對不同組間的臨床與生化指標及VDR基因FokI多態(tài)性進行統(tǒng)計分析。結果NPDR組和PDR組的ff基因型頻率顯著高于DM組(χ2=7.49，4.448，P＜0.05)，NPDR組和PDR組的f等位基因頻率顯著高于DM組(χ2=8.333，5.227，P＜0.05);NPDR組和PDR組的ff基因型頻率顯著高于NC組(χ2=9.934，4.899，P＜0.05);，NPDR組和PDR組的f等位基因頻率顯著高于NC組(χ2=10.895，5.714，P＜0.05)，而NPDR和PDR組(Ff+FF)基因型頻率顯著低于NC組(χ2=9.934，10.895，P＜0.05)、NPDR和PDR組F等位基因頻率顯著低于NC組(χ2=4.899，5.714，P＜0.05);NPDR和PDR組(Ff+FF)基因型頻率顯著低于DM組(χ2=7.490，8.333，P＜0.01;NPDR和PDR組F等位基因頻率顯著低于DM組(χ2=4.448，χ2=5.227，P＜0.05);DR的多重危險因素分析示低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)和糖化血紅蛋白(HbA1c)與DR的患病率呈正相關，而VDR基因FokI多態(tài)性與DR發(fā)病危險呈負相關(β=－1.027，OR= 0.343，P＜0.01，CI:0.157～0.723)。結論中國漢族人群中存在VDR基因FokI多態(tài)性，f基因可能是中國漢族糖尿病患者易于發(fā)生DR的危險遺傳性標志。

VDR基因多態(tài)性;25羥基維生素D3;糖尿病視網(wǎng)膜病變

隨著糖尿病患病率增高［1］，糖尿病慢性并發(fā)癥患病率較前明顯增高，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的微血管并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致盲的重要原因之一。近年研究發(fā)現(xiàn)維生素D對胰島具有保護作用，25-(OH)VD3能抑制視網(wǎng)膜組織血管內(nèi)皮生長因子和轉化生長因子-1的表達［2］，其過度表達會誘導血管內(nèi)皮細胞和周細胞的凋亡，破壞血－視網(wǎng)膜屏障。VDR基因存在多態(tài)性，VDR基因FokI多態(tài)性能上調(diào)維生素D的表達水平，關于VDR基因多態(tài)性與DR的相關性報道較少，本課題旨在闡明VDR基因FokI多態(tài)性與DR的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象按照1999年WHO的DM診斷標準和糖尿病視網(wǎng)膜病變分期標準，選擇2010年1月至2013年12月在泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院及泰安市中心醫(yī)院就診的漢族、無親緣關系的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者254例(男120例，女134例)，分3組，僅單純T2DM(DM)組(無糖尿病急慢性并發(fā)癥)患者92例入選(男45例，女47例)，平均年齡(61.51±10.5)歲;經(jīng)眼底熒光造影檢查篩選，非增殖性視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)組:80例入選(男40例，女40例)，平均年齡(60.81±11.46)歲;PDR組: 82例入選(男40例，女42例)，平均(59.95±9.88)歲;選取同期健康個體120例(男58例，女62例)作為健康對照組(normal control，NC)。

1.2 方法臨床資料及生化指標檢測所有受試對象均測量身高、體重，計算體重指數(shù)(BMI)，在安靜狀態(tài)下、坐位測量3次右上臂血壓值，取其平均值，空腹抽取靜脈血，用于生化和25-(OH)VD3水平檢測，部分EDTA抗凝用于提取DNA，采用全自動生化分析儀測肝腎功、空腹血糖、血脂等;低壓液相層析柱法測糖化血紅蛋白(glycohemoglobin，HbA1c);采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中25-(OH) VD3水平(試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)，常規(guī)行尿常規(guī)、眼底鏡或眼底熒光素造影檢查。EDTA抗凝全血凍存于－80℃冰箱統(tǒng)一提取DNA; PCR反應:上游引物5＇-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3＇，下游引物5＇-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3＇，反應條件為95℃5分鐘預變性、94℃45秒變性、61℃45秒退火、72℃60秒延伸，循環(huán)35個，72℃8分鐘終末延伸。DNA純化后FokI限制性內(nèi)切酶酶切反應3小時，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)2200下觀察，以擴增片段長度鑒別基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0處理，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標準差表示，計量資料各組間的比較用單因素方差分析，計數(shù)資料的組間比較用χ2檢驗，糖尿病視網(wǎng)膜病變相關危險因素用Logistic回歸分析，P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VDR基因FokI多態(tài)性檢測結果經(jīng)限制性內(nèi)切酶FokI酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示ff純合子有2條片段，分別為196 bp、69 bp，F(xiàn)F純合子有1條片段，片段長度為265 bp，而Ff雜合型則同時具有265 bp、196 bp和69 bp共3條片段，見圖1所示。

圖1 VDR基因FokI各基因型電泳圖

2.2 組間VDR基因FokI基因型及等位基因分布頻率NC組、DM組、NPDR組和PDR組均存在F、f 2種等位基因和FF、Ff、ff 3種基因型，其分布符合Hardy-Weinberg平衡。NC組、DM組、NPDR組和PDR組ff基因型頻率分別為46.67%、50%、68.75%和69.51%，f等位基因頻率分別為67.5%、64.48%、81.25%和81.71%，NPDR組ff基因型及f等位基因頻率顯著高于NC組(χ2= 9.934，4.899，P＜0.05)和DM組(χ2=7.49，4.448，P＜0.05);PDR組ff基因型及f等位基因頻率顯著高于健康對照組(χ2=10.895，5.714，P＜0.05)和糖尿病組(χ2=8.333，5.227，P＜0.05);Ff基因型在NC組、DM組、NPDR組和PDR組分布頻率分別為41.67%、36.96%、25%和24.39%;F等位基因頻率分別為32.5%、31.52%、18.75%和18.29%，NPDR組Ff基因型及F等位基因頻率顯著低于NC組(χ2=6.486，4.899，P＜0.05)和DM組(χ2=4.366，4.448，P＜0.05);PDR組Ff基因型頻率及F等位基因頻率低于NC組(χ2=7.327，5.714，P＜0.05)和DM組(χ2=3.986，5.227，P＜0.05);在進行FF基因型頻率的組間比較時，因突變率低;各組之間均無顯著差異，將攜帶F等位基因的基因型(即Ff基因型和FF基因型)合為一組分析(Ff+FF型)，其分布頻率在NC組、DM組、NPDR組和PDR組分別為53.33%、50%、31.25%和 30.49%，NPDR組的Ff+FF型基因型頻率顯著低NC組DM組(χ2=9.934，7.490，P＜0.05)，PDR組Ff+FF型基因型顯著低NC組和DM組(χ2= 10.895，8.333，P＜0.05)，但各種基因型分布頻率和等位基因分布頻率在NC組和DM組之間，NPDR組和PDR組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組間VDR基因FokI基因型及等位基因分布比較(%)

2.3 T2DM 3個亞組間臨床及生化指標的比較DM組、NPDR組和PDR組之間年齡、性別構成比、BMI、血壓、血脂及HbA1c水平無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 VDR FokI不同基因型之間臨床及生化特征各基因型組間臨床指標比較示在DM中ff、Ff、FF之間性別構成比、病程、年齡、血壓、BMI、HbA1c、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDLC)水平無顯著差異(P＞0.05);ff基因型與Ff及FF基因型相比較，ff基因型中血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDLC)增高，25-(OH)VD3表達水平降低(P＜0.05)，見表2。

2.5 不同基因型組間DR發(fā)生率的比較在T2DM中，ff基因型的DR發(fā)生率為70.89%，F(xiàn)f基因型的DR發(fā)生率為54.05%，F(xiàn)F基因型組DR發(fā)生率為45.45%，ff基因型DR發(fā)生率高于Ff基因型組(χ2=6.615，P＜0.05)和FF基因型組(χ2=13.875，P＜0.01)，而Ff基因型組與FF基因型組相比無顯著差異(χ2=1.620，P＞0.05)。

表2 a各基因型臨床資料比較(ˉx+s)

表2 b各基因型臨床資料比較(ˉx+s)

2.6 糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病的多重危險因素分析以有無DR為因變量，以多元Logistic回歸分析多因素對DR的影響，結果顯示25-OH-VD3、VDR ff基因型、BMI、HbA1c水平和LDL-c水平進入回歸方程，除25-OH-VD3外OR值均大于1，為DR發(fā)病的危險因素。

3 討論

VDR的相關研究已成為近幾年研究熱點，其中VDR與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關性為近年研究的熱點［3］。VDR基因位于12號染色體長臂q13－14，外顯子2上的第1個起始密碼子ATG上T-C的變異形成了FokI位點的多態(tài)性。變異后轉錄活性較高，能有效結合維生素D，維生素D與受體結合后作用于效應基因，調(diào)控基因表達，實現(xiàn)其特定功能。

VDR基因FokI多態(tài)性存在種族差異。該研究發(fā)現(xiàn)泰安及周邊地區(qū)漢族人存在VDR基因FokI多態(tài)性，有3種基因型分別為FF、Ff、ff，各組的VDR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。本研究發(fā)現(xiàn)DM中ff基因型的DR發(fā)生率為70.89%，F(xiàn)f基因型的DR發(fā)生率為54.05%，F(xiàn)F基因型的DR發(fā)生率為45.45%，ff基因型DR發(fā)生率高于Ff基因型組和FF基因型組，而Ff基因型組與FF基因型組相比無顯著差異，提示VDR FokI多態(tài)性可能與DR發(fā)病危險性相關。

血清25-OH-VD3是目前評估人體維生素D狀態(tài)的最佳指標。目前通常將血清25-OH-VD3水平正常水平定義為30～76 ng/ml，本實驗結果示＜30 ng/ml占66.8%，提示泰安及周邊地區(qū)人群維生素D不足較為普遍，與國內(nèi)研究結果一致［4－5］。在DR患者中血清25-OH-VD3更低，這與Payne JF等［6－7］國內(nèi)外報道一致相符。關于維生素D對DR的發(fā)病機制不明確，推測可能的機制為血清25-OH-VD3抑制視網(wǎng)膜組織中的血管內(nèi)皮生長因子和轉化生長因子-1的表達［2，8］，血管內(nèi)皮生長因子過度表達會誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡，增加毛細血管的通透性，破壞血—視網(wǎng)膜屏障，同時能誘導血管生成素-2的生成增加，共同促進視網(wǎng)膜新生血管的形成，從而導致視力損害［9－10］。

本課題為排除交互因素影響，以有無DR為因變量，選擇可能危險因素如25-OH-VD3、VDR ff基因型、BMI、HbA1c水平和LDL-C水平等作自變量行Logistic回歸分析，結果表明攜帶VDR FokI位點f等位基因者更易發(fā)生DR，當然基因不能從根本上決定DR的發(fā)生，但提供了環(huán)境因素發(fā)揮作用的基礎。目前我國糖尿病患病率高達15.5%，此研究有利于從基因水平篩查，對攜帶f等位基因群體進行重點追蹤及早干預，減少DR的發(fā)生有重要的現(xiàn)實意義。該研究樣本量有限，本研究僅從單個基因位點分析對DR的影響有一定的局限性，今后將加大樣本量進一步研究。本研究還顯示，25-OH-VD3缺乏或不足也是DR的危險因素，推測可能適當補充維生素D能預防或改善糖尿病視網(wǎng)膜病變，但還需今后擴大樣本量進一步深入研究。

［1］YangW，Lu J，Weng J，et al.Prevalen of Diatebes among men and women in China［J］.N-Engl J Med，2010，362(12):1090－1101.

［2］Ren ZG，Li W，Zhao QY，et al.The impact of 1，25-dihydroxy vitamin D3 on the expressions of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-b1 in the retinas of rats with diabetes［J］.Diabetes Res Clin Pract，2012，98(3):474－480.

［3］王寧，許迅.糖尿病視網(wǎng)膜病變相關基因多態(tài)性研究進展［J］.中華眼科雜志，2006，42(6):563－566.

［4］李毅中，潘源城，莊華烽，等.亞熱帶海濱城市就醫(yī)人群25(OH)維生素D水平［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2012，18(10):912－917.

［5］陳瓊，王亮，馬遠征，等.老年男性骨質(zhì)疏松性骨折患者血清25羥維生素D水平研究［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2013，19(9):941－943.

［6］Payne JF，Ray R，Watson DG，et al.VitaminD insufficiency in diabetic retinopathy［J］.Endocr Pract，2012，18(2):185－193.

［7］馮煥煥，艾明，江雙紅，等.糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血25羥基維生素D的測定及臨床意義［J］.醫(yī)學研究雜志，2012，4 (7):116－118.

［8］Javanmard SH，Hasanpour ZH，Abbaspoor Z，et al.Aqueous concentrations of VEGF and soluble VEGF receptor-1 in diabetic retinopathy patients［J］.Res Med Sci，2012，17(12):1124－1127.

［9］衡欣，陳悅.增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中轉化生長因子-1和結締組織生長因子水平的變化及意義［J］.眼科新進展，2013，33(4):363－365.

［10］Kono K，F(xiàn)ujii H，Nakai K，et al.Anti-Oxidative effect of Vitamin D analog on incipient vascular lesion in non-obese type 2 diabetic rats［J］.Am J Nephrol，2013，37(2):167－174.

Relationship between Vitamin D receptor gene FokI polymorphism and diabetic retinopathy in China

HOU Li-jun HUANG Dong-hui HAN Jing-jing
(Dept.of Endocrinology，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Taian 271000，China)

Objective:To study the Vitamin D receptor gene FokI polymorphism in Chinese Han population and to analyze the relationship between the polymorphism and diabetic retinopathy(DR).Methods:Two hundred and fifty four patients with type 2 diabetes mellitus recruited in this study were divided into NPDR group(non－proliferative diabetic retinopathy)，PDR group(proliferative diabetic retinopathy)and DM(diabetes without retinopathy)group.The normal control group consisted of 120 subjects.Genotypes were identified by PCR-RFLP among all the subjects，while other clinical parameters were measured.Serum levels of 25-(OH)VD3 were tested by the method of ELISA.Results:The frequencies of both genotype ff and allele f were significantly higher in the NPDR group and the PDR group than those in the NC group (χ2=9.934，4.899，P＜0.05;χ2=10.895，5.714，P＜0.05)and the DM group(χ2=7.49，4.448，P＜0.05;χ2=8.333，5.227，P＜0.05).However，the frequencies of genotype(Ff+FF)and allele F were significantly lower in the NPDR group and the PDR(χ2=7.490，8.333，P＜0.01 and χ2=4.448，5.227，P＜0.05).Multivariate logistic regression analysis showed that the levels of glycohemoglobin(HbA1c)，total cholesterol，low－density lipoprotein cholesterol presented a positive correlation with DR respectively，and the Vitamin D Receptor Gene FokI Polymorphism exhibited a negative correlation with DR(β=－1.027，OR=0.343，P＜0.01，CI:0.157～0.723).Conclusion:There is the presence of the VDRgene FokI polymorphism in the Han population in China，while allele f may be a protective genetic marker of DR.

Vitamin D receptor gene FokI polymorphism;serum 25-dihydroxyvitamin D;diabetic retinopathy

R587

A

1004-7115(2015)05-0490-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.003

2015-01-12)

侯麗君(1978－)，女，山東泰安人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事內(nèi)分泌學與代謝病臨床和基礎研究工作。