小鼠子宮蛻膜基質細胞促進樹突狀細胞的增殖

李 娜 高美華

(青島大學醫(yī)學院免疫學教研室，山東青島266071)

小鼠子宮蛻膜基質細胞促進樹突狀細胞的增殖

李 娜 高美華

(青島大學醫(yī)學院免疫學教研室，山東青島266071)

目的建立小鼠子宮蛻膜基質細胞(DSC)和小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)細胞共培養(yǎng)體系，探討DSC對DC增殖的影響。方法應用白細胞介素-4(IL-4)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導小鼠骨髓細胞分化為DC，F(xiàn)ACS檢測細胞表面分子和細胞增殖，ELISA檢測其分泌的細胞因子，構建DSC和DC共培養(yǎng)體系模型，動態(tài)觀察DSC對DC增殖的影響。結果小鼠骨髓來源DC高表達CD11c，共刺激分子CD80和CD86，MHCⅡ類分子Ia和MHCⅠ類分子H-2Kb。經(jīng)LPS刺激的DC分泌細胞因子IL-12(p70)、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明顯上調(P＜0.05)，并能夠促進抗原肽特異性T淋巴細胞增殖反應能力(P＜0.05)。在DSC和DC共培養(yǎng)10天后觀察到DSC明顯促進DC增殖。結論小鼠子宮蛻膜基質細胞能夠促進樹突狀細胞的增殖能力。

蛻膜基質細胞;樹突狀細胞;共培養(yǎng);細胞增殖

妊娠是一個復雜的生理過程，母體免疫系統(tǒng)不排斥同種異基因移植物的胚胎，且保護其正常發(fā)育、直至分娩，是母胎免疫耐受建立的體現(xiàn)，表明母體對胚胎存在著精細的免疫應答和免疫調控機制。母胎耐受與母胎界面細胞組成有關，母胎界面細胞組成相當復雜，根據(jù)其來源大致可分為三類:第一類是蛻膜免疫活性細胞(decidual immunocompetent cell，DIC);第二類為蛻膜基質細胞(decidual stromal cell，DSC)及蛻膜腺上皮細胞(decidual epithelial cell， DEC);第三類為侵入蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細胞(extravillous cytotrophoblast，EVCT)。妊娠早期，母體內(nèi)大量的免疫細胞遷移至子宮蛻膜，參與維持母胎免疫耐受和抗感染免疫。DSC具有廣泛的生物學功能，除參與蛻膜營養(yǎng)供應外，還能分泌多種激素、細胞因子和酶類，表達孕激素受體，調節(jié)胚泡著床及參與胎盤形成［1－3］。機體免疫應答反應的主體是免疫細胞，而樹突狀細胞(dendritic cells，DC)作為專職抗原提呈細胞是免疫應答的中心環(huán)節(jié)［4－5］。因此研究母胎界面細胞微環(huán)境對DC生物學功能的影響對生殖免疫學具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑小鼠重組IL-4、GM-CSF購自PerproTech公司，分裝(10 ng/μl)，－80°C保存?zhèn)溆?。RPMI1640完全培養(yǎng)基由RPMI1640(PAA Laboratories)、10%胎牛血清(PAA Laboratories)組成，4℃保存?zhèn)溆?LPS購自Sigma公司;小鼠抗兔PRL單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型免疫組化超敏SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒，抗體稀釋液及PBS緩沖液購自中山生物技術開發(fā)有限公司;I型膠原酶、胰蛋白酶、透明質酸酶和DMEM+F12培養(yǎng)基均購自Gibco公司;mIL-12 (p70)、mIL-6、mTNF-α和mIL-1 ELISA檢測試劑盒均購自R＆D公司;抗CD4磁珠，抗CD11b磁珠和抗CD11c磁珠均購自Miltenyi Biotec;熒光素標記的大鼠抗小鼠單抗CD4、CD8a、CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD86、Ia、H2-Kb、以及同型對照抗體和7-AAD均購自eBioscience公司。

1.1.2 主要儀器流式細胞儀(BD FACS calibur)，Auto MACS為德國Miltenyi Biotec公司，全波長多功能酶標儀(Tecan)，磁珠分選器(MACS QuadroMACS)，冷凍離心機(Thermo，Multifuge× 1R)，生物安全柜(NUAIRE)，CO2培養(yǎng)箱(力康，HF240)，超低溫冰箱(Thermo，F(xiàn)ORMA 700)，倒置顯微鏡(Olympus，1×2-SLP)。

1.1.3 實驗動物C57BL/6(H-2Kb)近交系小鼠，1～6周，雌性;由北京維通利化實驗動物技術有限公司提供。MHCⅡ類分子限制的OVA323－339抗原肽特異的TCR轉基因B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (H-2Kb)小鼠即OT-Ⅱ，4～6周，雌性;C57BL/6-Tg (CAG-EGFP)131Osb/LeySopJ(H-2Kb)小鼠即GFP小鼠，4～6周，雌性;購自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學院SPF級的動物房中。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌取股骨，沖洗出骨髓細胞，加Tris-NH4Cl裂解液室溫作用3～5分鐘，溶除去紅細胞，Hanks液洗二次，收集細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成1×106/ ml的細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，加rmGM-CSF 10 ng/ml、rmIL-4 1 ng/ml，每孔4 ml。置在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)基及懸浮細胞，重新加入新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基及mGM-CSF、mIL-4，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，加入低劑量的LPS(10 ng/ml)，2天后，收集懸浮細胞即為富集的骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrowderived dendritic cell，BMDC)，經(jīng)CD11c單抗磁珠標記后，過MiniMACS分選柱，去除陰性細胞，收集的陽性細胞為CD11c+DC。

1.2.2 形態(tài)學觀察和電鏡分析光學相差顯微鏡動態(tài)觀察DC培養(yǎng)過程中形態(tài)學變化，收取第8天DC，用PBS(0.01 M，pH7.2)輕輕離心洗滌一遍，用新鮮配置的固定劑(2%多聚甲醛+2%的戊二醛)固定后，電鏡觀察DC的超微結構。

1.2.3 細胞表面表型分析收集培養(yǎng)體系中不同發(fā)育階段的細胞，用PBS懸浮為1×106細胞/ml，加入離心管，100 μl/管，分別加入熒光標記抗體包括CD11c、CD86、CD40、CD80、Ia、CD40、H-2Kb，終濃度為2 μg/ml，置4℃標記30分鐘，PBS洗2遍，以熒光標記的同型Ig作為對照;用流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件分析。

1.2.4 細胞因子的檢測1 ml 1×106培養(yǎng)6天DC中加入10 ng LPS或PBS對照，48小時后收集培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明，檢測其中IL-12 (p70)、IL-6、TNF-α和IL-1 β的水平。

1.2.5 CD4+T細胞制備無菌分離OT-Ⅱ小鼠脾臟;用無菌針芯將脾臟磨碎，經(jīng)400目鋼網(wǎng)濾過并收集單細胞;Tris-NH4Cl裂解紅細胞，PBS洗滌2遍; CD11c和CD11b磁珠4℃標記15 min;AutoMACS陰性選擇;收集陰性細胞，再用CD4磁珠4℃標記15 min，AutoMACS陽性選擇，收集的陽性細胞為CD4+T細胞。

1.2.6 DC刺激抗原肽特異性T細胞增殖反應取OT-Ⅱ小鼠CD4+T細胞，用含OVA323～339抗原肽200 nM的培養(yǎng)基配成2×106/ml的細胞懸液(反應細胞);收取第8天DC用RPMI1640完全培養(yǎng)基配成2×105/ml的細胞懸液(刺激細胞);分別將刺激細胞和反應細胞按1:10混合并加入96孔圓底培養(yǎng)板共培養(yǎng)5天。同時取OT-Ⅱ小鼠CD4+T細胞單獨培養(yǎng)作為對照組。共培養(yǎng)5天細胞后棄上清，加入含有CD4-FITC和7-AAD的標記液，10 μl/孔，4℃標記15 min，然后補液體至200 μl，F(xiàn)ACS高速上樣40秒，計活細胞數(shù)。

1.2.7 蛻膜基質細胞培養(yǎng)及鑒定妊娠第6～8天時C57BL/6孕鼠，取出子宮剝除胎盤和胎鼠取得蛻膜組織，小鼠蛻膜基質細胞細胞培養(yǎng)按文獻進行［6］，免疫組化鑒定催乳素染色呈陽性為DSC。

1.2.8 DC與DSC的共培養(yǎng)預先將小鼠蛻膜基質細胞接種24孔培養(yǎng)板，分別接種GFP來源的第8天DC，置37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天半量換液，光學相差顯微鏡動態(tài)觀察共培養(yǎng)過程DC的增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用PEMS3.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。各實驗組每次實驗使用5只 C57BL/6小鼠，同樣的實驗重復3次。

2 結果

2.1 小鼠骨髓樹突狀細胞形態(tài)學變化培養(yǎng)過程中每天2次觀察細胞的形態(tài)，在2～3天時見有樹突狀細胞集落形成，第4～5天，且有部分樹突狀細胞從集落脫落下來，懸浮于培養(yǎng)基中，到第5～8天，有大量樹突狀細胞懸浮。LPS刺激后，典型的樹突狀細胞為低密度大細胞，圓形或不規(guī)則形，表面有豐富的伸長的毛刺，懸浮不貼壁(圖1)。電鏡分析示DC有大量伸展的突起，有不規(guī)則形核，胞漿中線粒體豐富。

圖1 光學顯微鏡下小鼠骨髓樹突狀細胞形態(tài)學變化

2.2 小鼠骨髓樹突狀細胞表面分子的檢測培養(yǎng)了6天的樹突狀細胞接受LPS刺激后2天，樹突狀細胞高水平表達特異性標志CD11c，表達MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子中共刺激分子CD40、CD80、CD86(圖2)。

圖2 LPS刺激后第8天的樹突狀細胞表型

2.3 小鼠骨髓樹突狀細胞細胞因子的檢測培養(yǎng)了6天的樹突狀細胞接受LPS刺激后2天，分泌IL-1 β、IL-6、TNF-α和IL-12(p70)水平均明顯上調(P＜0.05)(圖3)。

圖3 LPS刺激后第8天的樹突狀細胞上清中IL-1、IL-6、TNF和IL-12(p70)的水平

2.4 小鼠骨髓樹突狀細胞刺激抗原肽特異性CD4+T細胞的增殖DC能刺激OVA323－339抗原肽特異反應的CD4+T淋巴細胞增殖(圖4)，表明樹突狀細胞具有抗原提呈功能。

圖4 樹突狀細胞刺激抗原肽特異性T細胞增殖反應

2.5 樹突狀細胞在常規(guī)培養(yǎng)液中不能長期存活培養(yǎng)了8天的GFP小鼠樹突狀細胞，在體外常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后，細胞開始死亡，10天幾乎全部死亡，小鼠骨髓樹突狀細胞不能在體外長期存活(圖5)。

圖5 樹突狀細胞不能在體外長期存活

2.6 小鼠蛻膜基質細胞培養(yǎng)小鼠蛻膜基質細胞貼壁生長，呈較細長的成纖維型和不規(guī)則的內(nèi)皮型，核呈卵圓形，位于細胞中央，核仁清晰，有豐富的胞質顆粒。DSC具有合成催乳素的特性，合成的催乳素存在于胞質內(nèi)，可用此特性鑒定DSC。免疫組化顯示催乳素染色呈陽性，染色特點為胞質內(nèi)可見細小的棕色顆粒，且越近胞核染色越深。2.7子宮蛻膜基質細胞支持骨髓來源的樹突狀細胞增殖既然DC在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)體外不能長期存活，那么在DC與DSC共培養(yǎng)體系中，DC是否能夠存活并增殖呢?實驗結果發(fā)現(xiàn)體外共培養(yǎng)DC與DSC 5天后，DC仍能存活并有少量增殖;共培養(yǎng)10天后，小鼠子宮蛻膜基質細胞能夠明顯促進樹突狀細胞的增殖(圖6)。

圖6 小鼠子宮蛻膜基質細胞能夠促進樹突狀細胞的增殖(200×)

3 討論

目前，體外培養(yǎng)的基質細胞是研究微環(huán)境的重要模型，原代培養(yǎng)基質細胞可能有別于體內(nèi)基質細胞組分，不能完全模擬體內(nèi)微環(huán)境的復雜性。所以，在蛻膜基質細胞進行體外培養(yǎng)過程中應盡量保存其原有組織細胞組分，使體外培養(yǎng)細胞的模式與生理狀態(tài)下基本相似，這需要建立一個穩(wěn)定的DSC體外培養(yǎng)體系，為模擬母胎界面微環(huán)境提供一個體外研究模型。母胎耐受與母胎界面細胞組成有關［7－10］，DC作為專職抗原提呈細胞(APC)是免疫應答的中心環(huán)節(jié)和誘導免疫耐受的重要細胞，因此要研究樹突狀細胞在母胎免疫耐受中的作用，建立DC體外培養(yǎng)技術獲得足夠數(shù)量的有功能的DC就顯得非常重要。DC通過形態(tài)學特征、組合性細胞表面標志分子和能否刺激初始型T細胞增殖等多個方面加以綜合判斷，即具有典型樹突狀形態(tài)、膜表面高表達MHCⅡ類分子、能移行至淋巴器官和刺激初始型T細胞增殖活化，并具有一些相對特異性表面標志的一類細胞，才能稱為樹突狀細胞。本研究應用IL-4和GM-CSF誘導培養(yǎng)的骨髓來源的DC，光鏡下為低密度大細胞，圓形或不規(guī)則形，表面有豐富的伸長的毛刺，懸浮不貼壁。電鏡分析顯示DC有大量伸展的突起，有不規(guī)則形核，胞漿中線粒體豐富。發(fā)現(xiàn)DC高水平表達CD11c、MHC分子和共刺激分子。DC接受LPS刺激后，分泌IL-12(p70)和促炎因子水平增強，并能夠促進抗原肽特異性T淋巴細胞增殖反應，符合DC的生物學特性。

近年來免疫微環(huán)境與免疫細胞的相互作用成為免疫學研究的熱點。曹雪濤等發(fā)現(xiàn)成熟DC并非終末細胞，在脾臟基質微環(huán)境下通過Fibronectin和TGF-β的作用可以分化為一種免疫表型獨特的新型樹突狀細胞亞群，通過釋放NO可顯著抑制T細胞的增殖以發(fā)揮免疫調控作用［11］。O’Neill及Randolph的工作亦證實免疫微環(huán)境可影響DC的發(fā)育，Svensson等則用成纖維細胞和巨噬細胞組成的脾臟基質細胞誘導造血前體細胞分化為分泌IL-10的CD11cloCD45RB+調節(jié)性DC［12］，這些結果表明在免疫微環(huán)境的影響下DC的分化可能會成為機體一種重要的免疫調節(jié)方式。本實驗建立了以妊娠早期子宮蛻膜基質細胞為主體的免疫微環(huán)境/樹突狀細胞相互作用的體外研究模型，發(fā)現(xiàn)妊娠早期子宮DSC能夠支持骨髓來源的GM-CSF和IL-4誘導培養(yǎng)了8天的CD11c+樹突狀細胞的生長，可使DC發(fā)生大量的增殖。那么，DSC為主體的微環(huán)境誘導增殖的DC具有何種免疫調節(jié)功能呢，這需要在相應的實驗模型中進一步深入研究。本研究有助于深刻理解機體是如何調控免疫應答、維持自身的穩(wěn)定，為詮釋妊娠過程中耐受形成提供新思路。

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The mouse decidual stroma cells inducing the proliferation of dendritic cells in vitro

LI Na GAO Mei-hua
(Dept.of Immunology，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China)

Objective:To investigate the effects of decidual stroma cell(DSC)on the proliferation of dendritic cells (DC)by developing a co-culture system with the two cells.Methods:Cells isolated from the mice bone marrow were cultured with GM-CSF and IL-4 cytokines，then cell surface markers and cell proliferation were detected by FACS，and cytokines were assayed by ELISA.Moreover，we developed a co-culture system with DSC and DC，and dynamically observed the effects of DSC on the proliferation of DC.Results:Bone marrow derived DC expressed high levels of CD11c，CD80，CD86，MHC-II，and MHC-I molecules.The secretion of IL-12(p70)，IL-6，TNF-α and IL-1 were increased significantly treated by LPS(P＜0.05)，and the ability to stimulate antigen specific T cell proliferation was also enhanced(P＜0.05).In addition，the proliferation of DC was increased after we cocultrued DSC and DC for 10 days.Conclusion:The proliferation of DC increases when induced by the mice DSC in vitro.

decidual stroma cell;dendritic cell;coculture;cell proliferation

R392

A

1004-7115(2015)05-0481-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.001

2015-01-08)

國家自然科學基金項目(30872322)。

李娜(1981－)，女，山東濰坊人，主治醫(yī)師，在讀碩士生，主要從事生殖免疫學研究。

高美華，E-mail:meihuagao66@163.com。