ARTP誘變選育高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)研究

薛 剛,陳利娟,吳 斌,何冰芳

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

ARTP誘變選育高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)研究

薛 剛,陳利娟,吳 斌,何冰芳*

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

以高溫環(huán)境土樣中篩選的產(chǎn)高溫蛋白酶菌為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)選育出一株高產(chǎn)突變株BacilluslicheniformisTP1-5,產(chǎn)酶活力達(dá)到33200U/mL,為出發(fā)菌株的1.56倍。通過(guò)乙醇沉淀和陰離子交換層析兩步純化,獲得電泳純的高溫蛋白酶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該蛋白酶為高溫堿性絲氨酸蛋白酶,酶的最適pH為10.0,最適反應(yīng)溫度為60℃,具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性;對(duì)離子型和非離子型表面活性劑均具有很高的耐受性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

高溫蛋白酶,誘變選育,純化,酶學(xué)性質(zhì)

蛋白酶是一類(lèi)存在于動(dòng)物、植物及微生物中的蛋白質(zhì)水解酶類(lèi),廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、紡織及皮革處理等行業(yè)[1]。普通蛋白酶往往熱穩(wěn)定性差,催化溫度低,因此其在實(shí)際應(yīng)用上受到較大的限制。而高溫蛋白酶是一類(lèi)最適催化溫度為60～80℃的蛋白酶,對(duì)高溫、酸堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑具有良好的抗性,可作為高效工業(yè)生物催化劑,拓寬蛋白酶制劑的應(yīng)用范圍[2]。

分離自如溫泉、火山、堆肥等高溫環(huán)境的極端微生物是高溫蛋白酶的重要來(lái)源[3-4]。通常從自然界所篩選菌種的產(chǎn)酶能力難以達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)所需要的水平,因此人們采用對(duì)野生菌種進(jìn)行誘變選育,以及目標(biāo)酶類(lèi)的高效異源表達(dá)等手段來(lái)進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力。常壓室溫等離子體誘變是一種新型的育種技術(shù),該技術(shù)可以快速高效地突變各類(lèi)微生物,已成為獲取高產(chǎn)菌株的有效方法[5]。

本研究通過(guò)對(duì)自行篩選的產(chǎn)高溫蛋白酶菌株BacilluslicheniformisTP1進(jìn)行常溫室壓等離子體誘變選育,獲得了一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株,并對(duì)其所產(chǎn)高溫蛋白酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究,為進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)高溫蛋白酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisTP1) 由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得;酵母粉、蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司;酪蛋白 Sigma Aldrich公司;其他試劑 均為化學(xué)純,采購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

APTP生物育種機(jī) 北京思清源生物技術(shù)公司;AKTA prime plus蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司;紫外分光光度計(jì)UV-2102C 尤尼柯儀器有限公司;冷凍離心機(jī)CR21G 日立工機(jī)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10(固體LB培養(yǎng)基則再加20g/L的瓊脂粉)。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉5,NaCl 5,營(yíng)養(yǎng)瓊脂20,10%(v/v)脫脂奶粉溶液(10g/L,單獨(dú)滅菌,108℃,30min)。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,豆粕粉30,Na2HPO44,MgSO40.2,CaCl20.2,pH自然。

1.3 蛋白酶活力測(cè)定

采用紫外分光光度法,參照文獻(xiàn)[6],略有改動(dòng)。緩沖液是50mmol/L,pH10.0的Gly-NaOH緩沖液,反應(yīng)溫度為60℃。蛋白酶活力單位的定義:在相應(yīng)條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需要的酶量。

1.4 ARTP誘變方法

按照ARTP生物誘變育種機(jī)的操作流程,以氦氣作為工作氣體,設(shè)定功率為100W,通氣量為10L/min,等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2mm[5]。為了尋找最佳誘變條件,設(shè)定不同的處理時(shí)間(20,40,60,80s),然后將處理后的樣品稀釋涂布至LB平板,通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)以未處理樣品為對(duì)照計(jì)算致死率。

1.5 突變菌株選育

初篩:將最適處理時(shí)間處理后的樣品稀釋后涂布至含脫脂牛奶的篩選平板,37℃培養(yǎng)48h后測(cè)定水解圈直徑與菌落直徑之比(HC比值),根據(jù)HC比值的大小初步衡量該菌株產(chǎn)酶能力的高低。

復(fù)篩:接具有較高HC比值突變株至LB液體培養(yǎng)基中,于37℃、180r/min培養(yǎng)過(guò)夜得到種子液,按2%接種量接入至發(fā)酵培養(yǎng)基中,在相同條件下振蕩培養(yǎng)60h,發(fā)酵液離心(10000r/min,10min)后取上清測(cè)定蛋白酶活力。

1.6 高溫蛋白酶的分離純化

1.6.1 乙醇沉淀 取20mL粗酶液上清,分別按30%、40%、50%、60%、70%及80%的乙醇濃度依次加入預(yù)冷的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀,每級(jí)沉淀結(jié)束后4℃靜置2h,離心(12000r/min×15min,4℃)取上清進(jìn)行下一級(jí)沉淀。沉淀蛋白分別用等量的pH10.0、50mmol/L的Gly-NaOH緩沖液溶解并測(cè)定酶活力。

1.6.2 DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析 將上述乙醇沉淀純化所得酶液進(jìn)行DEAE弱陰離子層析,平衡緩沖為50mmol/L、pH9.5的Gly-NaOH緩沖液,洗脫緩沖是平衡緩沖液中加入1mol/L的NaCl,流速設(shè)定為1mL/min,上樣后收集穿透峰及洗脫峰,檢測(cè)各收集峰的酶活力及蛋白濃度。

1.6.3 SDS-PAGE電泳分析 采用濃度為12.5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)—聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)垂直板電泳[7]。

1.6.4 蛋白含量測(cè)定 采用Brandford法[8],標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白(BSA)。

1.7 蛋白酶性質(zhì)的研究

1.7.1 蛋白酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 配制pH6.0～12.0的緩沖液,并用各種緩沖配制相應(yīng)pH的酪蛋白底物溶液,純化后的蛋白酶在pH6.0～12.0條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定以確定最適pH。將適當(dāng)稀釋的酶液分別與不同pH緩沖混合,40℃保溫60min后,取樣測(cè)殘余酶活力,由此確定蛋白酶的pH穩(wěn)定性。

1.7.2 蛋白酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 為考察純化后的蛋白酶的最適反應(yīng)溫度,在最適pH條件下,于不同溫度(30～70℃)測(cè)定純酶的酶活力。在熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,純化的酶液經(jīng)不同溫度處理60min后,在標(biāo)準(zhǔn)條件下檢測(cè)蛋白酶活力。

1.7.3 抑制劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活力的影響 純化后的酶液與不同濃度的各種抑制劑或表面活性劑混合,30℃下放置30min后檢測(cè)蛋白酶殘余酶活力,以不加抑制劑的為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子體處理時(shí)間對(duì)BacilluslicheniformisTP1的致死率

誘變處理劑量或時(shí)間不僅影響致死率,同時(shí)能顯著影響突變效率,在一個(gè)合適的突變效率區(qū)間進(jìn)行有效的篩選是菌種選育的關(guān)鍵之處。本研究首先對(duì)出發(fā)菌株TP1進(jìn)行不同時(shí)間的等離子體射流處理,其致死率曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。常溫室壓等離子體對(duì)TP1菌株的損傷作用效果明顯,隨著等離子體射流處理時(shí)間的增加,其致死率逐漸增大。處理40s殺死約60%的菌體;處理時(shí)間達(dá)到80s以上時(shí),菌株致死率接近100%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)致死率在90%左右時(shí),誘變處理對(duì)細(xì)胞的誘變效應(yīng)較強(qiáng)[9-10],所以本研究采用60s處理時(shí)間(致死率約為92%)對(duì)菌株BacilluslicheniformisTP1進(jìn)行誘變。

圖1 等離子體處理Bacillus licheniformis TP1的致死率曲線(xiàn)Fig.1 The lethal rate of Bacillus licheniformis TP1 treated by ARTP

2.2 ARTP誘變選育蛋白酶高產(chǎn)突變株

出發(fā)菌株TP1經(jīng)ARTP誘變處理,通過(guò)初篩和復(fù)篩選育出7株產(chǎn)酶活力相對(duì)較高的菌株(表1)。由表1可以看出,水解圈與菌落直徑比(HC值)與復(fù)篩所測(cè)酶活力大小呈正相關(guān),所以初篩使用的水解圈指示標(biāo)記能夠排除大量的負(fù)突變菌株,大大提高了篩選的效率。其中TP1-5菌株的酶活力最高且遺傳性狀穩(wěn)定(傳代20次產(chǎn)酶能力無(wú)下降),通過(guò)初步發(fā)酵優(yōu)化其酶活力達(dá)到33200U/mL,是出發(fā)菌株酶活力的1.56倍。目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道的產(chǎn)高溫蛋白酶菌株產(chǎn)酶能力大都比較低,例如彭素萍等[11]篩選到的耐熱菌BY25產(chǎn)高溫蛋白酶活力為4170U/mL;唐兵等[12]報(bào)道的嗜熱脂肪芽孢桿菌WF146高溫蛋白酶產(chǎn)量為600U/mL;黃光榮等[13]分離到的嗜熱芽孢桿菌HS08產(chǎn)高溫蛋白酶活力為6754U/mL。本研究通過(guò)誘變選育獲得的高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株,具有產(chǎn)酶活力高且遺傳性狀穩(wěn)定的特點(diǎn),為實(shí)現(xiàn)高溫蛋白酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

表2 蛋白酶TP1純化結(jié)果Table 2 Purification of the protease from Bacillus licheniformis TP1-5

表1 菌株TP1誘變選育的篩選結(jié)果Table 1 The screening result of mutant strains TP-1

2.3 蛋白酶的分離純化

由于有機(jī)溶劑沉淀法方便快捷的特點(diǎn),本研究采用乙醇沉淀法對(duì)高溫蛋白酶進(jìn)行初步純化。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí),目的蛋白開(kāi)始大量沉淀,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),目的蛋白基本沉淀完全,故選取50%～70%沉淀部分回收,并用pH10.0的Gly-NaOH緩沖溶解用于下一步的純化。通過(guò)乙醇沉淀,目的蛋白酶得到初步純化及濃縮,酶活回收率為71%,純化倍數(shù)為1.9倍(表2)。

將乙醇沉淀回收的酶液上樣至pH9.5 Gly-NaOH緩沖平衡好的陰離子交換層析柱,收集穿透峰及洗脫峰。酶活力測(cè)定表明,目的蛋白在pH9.5的條件下不能吸附到柱上,而雜蛋白絕大部分被吸附,從而通過(guò)收集穿透峰獲得了電泳純的目的蛋白(圖2)。由此推斷該蛋白酶的等電點(diǎn)較高,在pH9.5條件下仍不能帶有足夠的負(fù)電荷吸附至填料。本研究通過(guò)兩步純化獲得了電泳純的蛋白酶,該酶的表觀分子量約為30ku,最終酶活回收率為53%,純化倍數(shù)為3.1倍(表2)。

圖2 SDS-PAGE分析蛋白純化結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified protease注:Line 1:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;Line 2:粗酶液; Line 3:乙醇沉淀產(chǎn)物;Line 4:柱層析穿透峰。

2.4 蛋白酶TP1的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 蛋白酶TP1的最適反應(yīng)pH以及pH穩(wěn)定性 催化體系pH對(duì)蛋白酶活力的影響見(jiàn)圖3(a),該酶在pH8.0～11.0范圍內(nèi)具有較高的水解活力,最適pH10.0～11.0,pH7時(shí)僅為最適pH時(shí)活力的一半,表明該酶為典型的堿性蛋白酶。蛋白酶TP1的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖3(b),該酶在pH8.0～10.0范圍內(nèi)未觀察到酶活損失,顯示了很高的穩(wěn)定性。當(dāng)pH達(dá)到11時(shí),酶活力損失較大,表明該酶的最適催化pH并非其穩(wěn)定pH,所以該酶應(yīng)保存在pH8.0～10.0的體系中,并宜在pH10.0以下實(shí)現(xiàn)其高效催化。

圖3 蛋白酶TP1的最適反應(yīng)pH(a)及pH穩(wěn)定性(b)Fig.3 The optimum pH and the pH stability of protease TP1

2.4.2 蛋白酶TP1的最適反應(yīng)溫度以及熱穩(wěn)定性 催化反應(yīng)溫度對(duì)蛋白酶TP1的酶活力影響見(jiàn)圖4。圖4(a)表明,蛋白酶TP1在50～60℃范圍內(nèi)具有較高活力,該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,屬于高溫蛋白酶的范疇。該酶的穩(wěn)定性如圖4(b)所示,蛋白酶TP1在30～50℃保溫1h后,酶活殘留95%以上,在最適溫度60℃條件下剩余酶活70%左右,但當(dāng)保溫溫度達(dá)到70℃時(shí),蛋白酶TP1變性失活較快,基本檢測(cè)不到剩余酶活,這表明該酶在40～60℃范圍內(nèi)具有較高的熱穩(wěn)定性。

目前已報(bào)道的高溫蛋白酶主要來(lái)源于芽孢桿菌,如BacillusstearothermophilusWF146[12],BacilluslicheniformisMIR29[5],BacillussubtilisPE-11[14]等,這些蛋白酶最適溫度通常都在60～80℃,并且在高溫條件下具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,在高溫洗滌、制革工業(yè)、食品高溫處理等行業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。

圖4 蛋白酶TP1的最適反應(yīng)溫度(a)及熱穩(wěn)定性(b)Fig.4 Effects of temperatures on the activity and thermal stability of protease TP1

2.4.3 抑制劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活力的影響 本研究進(jìn)一步考察了蛋白酶抑制劑苯、表面活性劑、變性劑等對(duì)蛋白酶的影響,結(jié)果如表3所示。EDTA對(duì)蛋白酶TP-1-5無(wú)抑制作用,表明該蛋白酶不屬于金屬酶,常見(jiàn)金屬離子(Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+)對(duì)該酶活力影響較小(數(shù)據(jù)未列出)。該蛋白酶被典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF強(qiáng)烈抑制,由此可判斷該酶屬于絲氨酸蛋白酶。其他的蛋白抑制劑(β-巰基乙醇)和變性劑(Urea)對(duì)蛋白酶

表3 抑制劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活性的影響Table 3 Effect of inhibitors and surfactants on protease activity

TP1均無(wú)顯著影響,說(shuō)明該酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。此外離子型表面活性劑(CTAB、SDS)與非離子型表面活性劑(TritonX-100、Tween-80)對(duì)蛋白酶TP1均無(wú)抑制作用,甚至有一定的激活作用,這一性質(zhì)與已報(bào)道的BacilluslicheniformisXG12[15]所產(chǎn)的表面活性劑穩(wěn)定性堿性蛋白酶相似。高溫蛋白酶TP1對(duì)多種變性劑和表面活性劑有比較強(qiáng)的耐受性,可望應(yīng)用于高溫洗滌等用途。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)自行篩選的高溫蛋白酶產(chǎn)生菌進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變,獲得高產(chǎn)突變株TP1-5,其酶活達(dá)到33200U/mL,相比原始菌株提高了56%,其酶活產(chǎn)量顯著高于國(guó)內(nèi)已報(bào)道的產(chǎn)高溫蛋白酶菌株。

通過(guò)乙醇沉淀和DEAE柱層析純化,獲得了電泳純的高溫蛋白酶,酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該酶屬于堿性絲氨酸蛋白酶,最適pH為10.0,最適反應(yīng)溫度為60℃,同時(shí)該酶對(duì)抑制劑和表面活性劑有較強(qiáng)的抗性。以上優(yōu)良特性,預(yù)示高溫蛋白酶在高溫洗滌、制革工業(yè)及飼料行業(yè)的角蛋白水解等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Selection of high-yield thermostable protease producing strain by ARTP and the study on its enzymological properties

XUE Gang,CHEN Li-juan,WU Bin,HE Bing-fang*

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

In order to obtain an industrial strain with higher thermostable protease production,the original strain ofBacilluslicheniformisTP1 was mutated by atmospheric and room temperature plasmas. A good genetic stability strain TP1-5 was screened from the mutants,which produced 33200U/mL from initial 21300U/mL of the thermostable protease. The protease was purified by ethanol precipitation and anion exchange chromatography to electrophoretic homogeneity. The purified protease had a good pH stability and thermal stability,with optimal temperature and pH was 60℃ and 10.0. The protease also exhibited high stability towards surfactants such as SDS,Tween-80,TritonX-100etal.

thermostable protease;atmospheric and room temperature plasmas(ARTP);purification;enzyme characterization

2014-04-01

薛剛(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)。

*通訊作者:何冰芳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：酶工程。

國(guó)家863計(jì)劃(2012AA022205)；國(guó)家973計(jì)劃(2011CB710800)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.028