豆腐酸漿老湯中產(chǎn)酸菌的分離篩選與鑒定

喬支紅,李艷芳,許榮華,姜 慧,張 琦,修 宇

(1.北京聯(lián)合大學(xué)旅游學(xué)院,北京 100101;2.北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)一站,北京 100075)

豆腐酸漿老湯中產(chǎn)酸菌的分離篩選與鑒定

喬支紅1,李艷芳2,許榮華1,姜 慧1,張 琦1,修 宇1

(1.北京聯(lián)合大學(xué)旅游學(xué)院,北京 100101;2.北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)一站,北京 100075)

利用MRS選擇性培養(yǎng)基,從分別采自山東鄒平、陜西榆林、河北淶源、云南石屏、云南建水及云南元陽的6份酸漿老湯中分離純化出12種菌落形態(tài)不一樣的乳酸菌,分別采用MC改良培養(yǎng)基和發(fā)酵黃漿水pH及產(chǎn)酸量的監(jiān)測對12種菌進(jìn)行初篩及復(fù)篩,篩選出一株產(chǎn)酸較快、較高的乳酸菌,并對該菌株進(jìn)行了菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析的鑒定實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:該菌株為革蘭氏陽性菌,菌落特征為白色,圓形,表面突起,不透明,邊緣整齊,鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為球菌、直徑為0.8μm,四聯(lián)或成串排列,經(jīng)生理生化及16S rDNA序列鑒定確定該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌(Enterococcusfaecium),遺傳穩(wěn)定性較好。

豆腐酸漿老湯,分離,鑒定,屎腸球菌

酸漿豆腐為我國民間傳統(tǒng)的一種豆腐制品,有上百年的歷史,它是以酸漿為凝固劑制作而成。其味道獨(dú)特,彈性較好,是農(nóng)家樂豆腐宴中的極品,深得旅游者的喜愛[1]。在民間酸漿豆腐制作的調(diào)研中發(fā)現(xiàn),酸漿豆腐的制作多為手工作坊,工業(yè)化生產(chǎn)的廠家?guī)缀鯖]有,其根本原因在于酸漿無法標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),進(jìn)而制約了酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)。

農(nóng)民制作豆腐所用的酸漿,是用酸漿老湯為“酵種”,再加入新的黃漿水放置一晚后酸化而成。如不加入酸漿老湯,其酸化速度較慢。而且發(fā)現(xiàn),不同地方所制作的酸漿顏色、風(fēng)味有所不同,酸漿豆腐的口感也略有不同?？梢?老湯對于酸漿及酸漿豆腐的制作及風(fēng)味有較大的影響。酸漿老湯為自然發(fā)酵而成,微生物種類繁多,不同的地理環(huán)境決定了老湯中優(yōu)勢菌群的種類,優(yōu)勢菌也較固定,進(jìn)而影響酸漿及酸漿豆腐的質(zhì)量?？梢哉f,酸漿老湯中的優(yōu)勢微生物是制作酸漿及酸漿豆腐的關(guān)鍵所在。若從酸漿老湯中將使酸漿變酸的主要微生物分離篩選出,純種發(fā)酵酸漿,即可將酸漿量化進(jìn)行大規(guī)模的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),進(jìn)而可完成酸漿豆腐的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),為我國民間酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)提供有力的前提保證。目前,國內(nèi)有關(guān)豆腐酸漿中微生物的篩選研究也有,然而,多數(shù)篩選的實(shí)驗(yàn)材料為自制的黃漿水酸化后或點(diǎn)漿所用的酸漿[2-4],其微生物受環(huán)境影響較大。

本研究以采集的中國六個不同地方的酸漿老湯為試樣,分析不同地方酸漿老湯中乳酸菌的分布情況,利用乳酸菌選擇性培養(yǎng)基從中分離篩選產(chǎn)酸較多、遺傳穩(wěn)定性較好的優(yōu)勢乳酸菌種,并進(jìn)行鑒定,為酸漿的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供一株較好的生產(chǎn)菌種。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

黃漿水 北京道爾泰豆腐店提供；酸漿老湯 采自山東鄒平、河北淶源、陜西榆林、云南建水、云南石屏、云南元陽；培養(yǎng)基:黃漿水液體培養(yǎng)基(自制:黃漿水+2%葡萄糖121℃高壓滅菌)；MRS固體、液體培養(yǎng)基；改良MC固體培養(yǎng)基 北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；API 20 STREP乳酸菌生化鑒定試劑盒 梅里埃(中國)有限公司。

PHS-25酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司；DHP-420BS電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐公司；ZDX-35BI(30L)滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SL602N電子天秤 上海民橋精密儀器公司；超聲波振蕩器,DH-101-OBS電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐公司；SW-CJ-2FD超凈臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；YS100攝影生物顯微鏡 南京江南光電股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 取5mL酸漿老湯接種于20mL滅菌黃漿水液體培養(yǎng)基內(nèi),放入37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h。

1.2.2 稀釋涂布 用滅菌生理鹽水將增殖培養(yǎng)后的菌液以十倍稀釋法稀釋到10-5、10-6、10-7三個稀釋度,每個稀釋度取菌液100μL,采用涂布平板法,分別涂布于MRS、改良MC兩種固體培養(yǎng)基上,涂布好的平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.2.3 乳酸菌的分離純化 取出培養(yǎng)好的MRS培養(yǎng)基平板,在超凈臺上觀察。其中,MRS培養(yǎng)基中挑取菌落特征不同的菌種,并對不同菌落特征的菌計(jì)數(shù),挑取單菌落在滅菌后MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離2～3次,直至純菌并編號,分別于10倍放大鏡下進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察,挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,于100倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行菌體形態(tài)觀察,并記錄。選取革蘭氏染色陽性菌接種于MRS斜面,于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后4℃保存,備用。

1.2.4 產(chǎn)酸菌種的初步篩選 分別將分離純化的12株革蘭氏陽性菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h后,稀釋適當(dāng)?shù)南♂尪群笸坎加诟牧糓C培養(yǎng)基[5]中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,觀察是否有溶鈣圈,如有溶鈣圈初步判定為產(chǎn)酸菌株。于MRS斜面培養(yǎng)后4℃保存,備用。

1.2.5 產(chǎn)酸菌種的復(fù)篩 乳酸量的測定:將初步篩選出的具有溶鈣圈的5種純種菌株接入MRS液體培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)24h后,用無菌生理鹽水以10倍稀釋法稀釋到10-6,涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,并于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取含相同菌數(shù)的不同菌液分別接進(jìn)裝有20mL滅菌新鮮黃漿水的試管中,每種菌接7支試管,于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。分別在2、4、6、8、10、12、24h時取出一支試管測定試管內(nèi)培養(yǎng)液的乳酸量。

乳酸含量測定用總酸測定方法[6],用標(biāo)定后的NaOH溶液(約0.08mol/L)進(jìn)行滴定測量,公式如下:

產(chǎn)酸量(以乳酸計(jì))=c×(v1-v0)×k×F/v×100

式中:C-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L(約0.08mol/L)；V1-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液在滴定待測樣時所消耗的體積,mL；V0-滴定黃漿水原樣消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH,mL(約0.3mL)；V-待測樣的體積,mL；F-樣品稀釋倍數(shù)；K-換算為主要酸的系數(shù),即1molNaOH相當(dāng)于乳酸的克數(shù),用乳酸計(jì)K=0.09。

黃漿水發(fā)酵液pH的測定:采用酸度計(jì)測定。

根據(jù)不同發(fā)酵時間下,菌種產(chǎn)酸能力的測定,篩選出產(chǎn)乳酸量高,發(fā)酵液pH下降快的菌株。

1.2.6 產(chǎn)酸菌的生理生化鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[7]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]中乳酸菌的生化鑒定實(shí)驗(yàn)方法,利用API 20 STREP生化反應(yīng)鑒定系統(tǒng)對復(fù)篩出的菌株進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 產(chǎn)酸菌的16S rDNA序列分析鑒定 將待檢菌株送于中國微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行16S rDNA序列測定,運(yùn)用Clust X軟件校準(zhǔn)排齊后,在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類。然后再對待測菌株與模式菌株16S rDNA序列利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性的定性實(shí)驗(yàn) 將待測菌株分別在液體培養(yǎng)基中傳代10次,取空白10mL,樣液10mL,用經(jīng)過約0.01mol/L的鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH滴定,測定每一代的產(chǎn)酸情況,方法同1.2.5。判斷其遺傳性能的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)折線圖采用Excel2007制作,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)(p<0.05),數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離出的12種不同菌種的菌落特征及菌體形態(tài)描述

經(jīng)多次分離純化,從六個不同地方的酸漿老湯中獲得共12株菌落形態(tài)特征不一樣的菌種,通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn),12株菌均為革蘭氏陽性菌。利用顯微鏡觀察菌株的菌體形態(tài)特征,均與乳酸菌相符。結(jié)果如表1所示。

表1 12種乳酸菌菌落特征及菌體形態(tài)描述結(jié)果Table 1 The description of colony characteristics and mycelia morphology of 12 strains

2.2 六個不同地方酸漿老湯中乳酸菌的分布情況

對不同地區(qū)酸漿老湯中的不同菌種進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,如圖1所示。

圖1 不同地方乳酸菌種分布情況Fig.1 The distribution of lactic acid bacterium in the different samples

自然環(huán)境對微生物的種類有較大的影響。從圖中,可以看到不同地方,由于自然環(huán)境不同,酸漿老湯中分布的乳酸菌種也有所不同,平均每個老湯樣品中有3～4種不同的乳酸菌；另外,也可以看到,同一菌種在不同地方中均有出現(xiàn),如10號菌種在山東鄒平、云南建水、云南石屏及陜西榆林四個地方的酸漿老湯中均有分布,且該菌為優(yōu)勢菌,說明該菌種具有發(fā)酵酸漿的共性。

2.3 產(chǎn)酸菌種的初篩結(jié)果

根據(jù)方法1.2.4對12株乳酸菌進(jìn)行溶鈣圈實(shí)驗(yàn),由于改良的MC培養(yǎng)基中添加了CaCO3,所以隨著乳酸菌的生長,乳酸菌產(chǎn)生的酸會溶解培養(yǎng)基中的CaCO3,在菌落周圍形成透明圈。如圖2所示:

圖2 菌株溶鈣圈示意圖Fig.2 The soluble calcium circle

選取有溶鈣圈的菌株進(jìn)入復(fù)篩,有溶鈣圈的菌株為3號、7號、9號、10號及11號菌。

2.4 產(chǎn)酸菌種的復(fù)篩結(jié)果

為比較各菌株的產(chǎn)酸能力,分析了3號、7號、9號、10號及11號乳酸菌在黃漿水發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸量及發(fā)酵液pH的變化,結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 24h內(nèi)發(fā)酵液乳酸量的變化Fig.3 Lactic acid production of fermented tofu whey in 24h

圖4 24h內(nèi)發(fā)酵液pH的變化Fig.4 The pH values of fermented tofu whey

黃漿水中含有蛋白質(zhì)、糖及微量礦物質(zhì)、維生素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[9-10],乳酸菌可很好的生長繁殖。從圖3中可以看出,乳酸菌利用黃漿水中的糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,隨時間的延長而呈上升的趨勢,相應(yīng)的發(fā)酵液的pH呈逐漸下降的趨勢(如圖4所示)。不同乳酸菌在黃漿水中的生長速度不同,所產(chǎn)生的乳酸量的多少及發(fā)酵液pH下降速度有所不同,從圖3、圖4中可以看出,在同一發(fā)酵時間里,10號菌產(chǎn)生的乳酸量較其它菌種多,相應(yīng)的發(fā)酵液的pH也較低,隨時間的延長,pH下降速度較快,直到發(fā)酵12h時,發(fā)酵液的pH達(dá)到3.51,發(fā)酵24h時達(dá)到3.26。六個地方所采集的酸漿老湯,pH平均為3.53,可見,10號菌具有較好的發(fā)酵性能,可作為酸漿標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵菌種。

表2 10號菌株遺傳穩(wěn)定性測定Table 2 The stability of genetic

2.5 10號菌遺傳穩(wěn)定性測定

將10號菌株分別在黃漿水液體培養(yǎng)基中傳代10次,測定每一代的產(chǎn)酸情況,結(jié)果如表2所示:

由表2中可知,10號菌株在液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10代,乳酸產(chǎn)量基本保持不變,說明此菌株在液體培養(yǎng)基中遺傳穩(wěn)定性較好,可作為酸漿老湯制作所用的發(fā)酵菌種。

2.6 10號菌菌種鑒定結(jié)果

2.6.1 菌落、菌體形態(tài)的鑒定結(jié)果 將10號菌株接種在MRS固體平板上37℃培養(yǎng)48h后,菌落呈圓形、表面突起,邊緣整齊,不透明,白色(如圖5所示)。對固體平板上的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)該菌體為球形,四聯(lián)或成串排列,直徑約為0.8μm(如圖6所示)。

圖5 10號菌在MRS培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)Fig.5 Colony morphology of 10 on MRS

圖6 10號菌的菌體形態(tài)Fig.6 Cellular morphology of 10

2.6.2 10號菌生理生化的鑒定結(jié)果 對10號菌進(jìn)行生理生化的常規(guī)鑒定實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)10號菌表現(xiàn)為45℃生長,產(chǎn)生黃色素,發(fā)酵甘油產(chǎn)酸,水解馬尿酸,同時對照API 鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌編碼,可初步判斷10號菌為腸球菌屬,生理生化表型特征結(jié)果如表3所示:

表3 10號菌生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 10

2.6.3 10號菌分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果 10號菌株16S rDNA的基因序列測序結(jié)果為:

圖7 10號菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育數(shù)Fig.7 16S rDNA phylogenetic tree of 10

將10號菌的序列提交GenBank,通過Blast程序與其中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,結(jié)果表明與該序列相似度高的相關(guān)菌株均為腸球菌屬,系統(tǒng)發(fā)育分析得出該菌與EnterococcuslactisBT159T(GU983697)和EnterococcusfaeciumATCC 19434T(DQ411813)兩株菌在同一分支上,親緣關(guān)系最近,相似性達(dá)99.7%以上,再結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征,可以初步確定該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌。

3 結(jié)論

通過本研究,從六個不同來源的酸漿老湯中分離純化到12種菌落形態(tài)不同的乳酸菌株,并篩選出5株(3號、7號、9號、10號及11號)產(chǎn)酸的乳酸菌株,根據(jù)產(chǎn)酸能力的測定,最終篩選到1株產(chǎn)酸高且遺傳穩(wěn)定性較好的乳酸菌種。經(jīng)菌種鑒定,該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌。將該菌種接種于滅菌的黃漿水中于37℃培養(yǎng)24h,可獲得pH為3.26的酸漿,與酸漿老湯的pH(3.5)相近,此酸漿經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),可制作成酸漿豆腐。

今后可將此菌作為酸漿標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的發(fā)酵菌種,為酸漿及酸漿豆腐的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了有力的保證。也可用于直接發(fā)酵豆?jié){,制作發(fā)酵豆腐[11-12]。

[1]喬支紅.乳酸菌發(fā)酵延長豆腐保質(zhì)期及抑菌機(jī)理的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[2]尹向壟,惠明,田青.豆腐酸漿中一株解淀粉乳桿菌的分離鑒定[J].中國釀造,2012,31(4):95-98.

[3]于海峰,宋俊梅,劉慶軍，等.發(fā)酵大豆乳清的乳酸菌的分離篩選研究[J].食品科技,2004(4):93-95.

[4]張彬,柳珊,呂瑩,等.云南石屏豆腐凝乳黃漿水中菌株的分離及產(chǎn)酸能力比較[J].食品工業(yè)科技,2011,32(4):189-196.

[5]張剛.乳酸細(xì)菌-基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:435.

[6]李啟隆,胡勁波主編.食品分析科學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:50.

[7]布坎南 R E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].中國科學(xué)院微生物研究所譯.北京:科學(xué)出版社,1984.

[8]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[K].北京:科學(xué)出版社,2001.

[9]唐鑫,陳卓然,黃新安,等.豆制品生產(chǎn)中黃漿水的綜合利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2010,4:97-98.

[10]Qiao Z H，Chen X D，Cheng Y Q，etal. Microbiological and chemical changes during the production of acidic whey,a traditional Chinese tofu-coagulant[J]. International Journal of Food Properties. 2010,13:90-104.

[11]劉恩岐,喬支紅. 發(fā)酵布丁豆腐生產(chǎn)工藝的研究[J].食品科學(xué),2006,27(6):128-130.

[12]喬支紅,許榮華,程永強(qiáng). 無凝固劑發(fā)酵豆腐生產(chǎn)工藝的初探[J].食品工業(yè)科技,2014,35(17)：227-231.

Isolation and identification of acid-producing lacticacid bacteria from tofu acid whey

QIAO Zhi-hong1,LI Yan-fang2,XU Rong-hua1,JIANG Hui1,ZHANG Qi1,XIU Yu1

(1.Tourism Insititute of Beijing Union University,Beijing 100101,China；2.Beijing Municipal Food and Wine Products Quality Supervision and Inspection Station,Beijing 100075,China)

12 strains of lactic acid bacterium were isolated from 6 different tofu acid whey from Shandong zouping,Shanxi yulin,Hebei laiyuan,Yunnan shiping,Yunnan jianshui and Yunnan yuanyang by MRS selective medium. 12 strains of lactic acid bacterium were preliminary screed by MC selective medium. On the basis of the measurement of fermented tofu whey’s pH values and lactic acid production in different fermented time,the high acid producing strain was screened out. The identification tests of colony morphology,physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis were studied for the acid producing strain. The results showed that the strain was gram-positive,circular,white,surface convex,opaque,and entire. According to physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis,the strain was identified asEnterococcusfaecium.

tofu acid whey;isolation;identification;Enterococcusfaecium

2014-04-17

喬支紅(1976-)，女，博士，講師，研究方向：中國傳統(tǒng)大豆制品。

北京市教委科研計(jì)劃(81106991314)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.029