高效液相色譜法測(cè)定過(guò)氧化碳酰胺中枸櫞酸含量

林新文，唐閃光，武欣倩，朱光冕，李 穎，海 樂(lè)

（1.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.湖南一格制藥有限公司，湖南 湘潭 411100）

過(guò)氧化碳酰胺是尿素與過(guò)氧化氫以氫鍵結(jié)合形成的配合物，臨床常用作靜脈給氧藥物，可治療因缺氧所致各種急重癥［1］。由于過(guò)氧化氫屬極弱酸（Ka=2.4×10-12），在堿性條件下易分解［2］，故需添加適量的pH調(diào)節(jié)劑穩(wěn)定其性質(zhì)。枸櫞酸又名檸檬酸，屬大分子有機(jī)酸，為藥物制劑中常用的pH調(diào)節(jié)劑，具有良好的理化特性。其添加量在藥典中未明確限定，可按實(shí)際生產(chǎn)需要量添加，但為了更好地確保臨床用藥的安全有效，采用準(zhǔn)確的測(cè)定方法，對(duì)于了解不同藥品中枸櫞酸的含量及對(duì)枸櫞酸加入量的控制有重要意義。目前枸櫞酸常用測(cè)定方法有高效液相色譜（HPLC）法、紫外-可見(jiàn)分光光度法、離子色譜法、氣相色譜法等［3-5］。其中，紫外-可見(jiàn)分光光度法的靈敏度較低，離子色譜法和氣相色譜法成本較高且操作較煩瑣。為此，本研究中采用HPLC法測(cè)定過(guò)氧化碳酰胺中枸櫞酸的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；MA105DU型電子天平（德國(guó)Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；Evolution 220型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

過(guò)氧化碳酰胺（批號(hào)分別為20191019，20191006，20191016）；枸櫞酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100396-201503，含量100%，規(guī)格為每支200 mg）；乙腈為色譜純，磷酸二氫銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫銨（A）-乙腈（以三乙胺調(diào)pH至7.0，B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制備

取枸櫞酸對(duì)照品25.28 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A溶解并定容，作為對(duì)照品貯備液；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A定容，混勻，即得對(duì)照品溶液。取過(guò)氧化碳酰胺樣品1.00 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A定容，混勻，即得供試品溶液。以流動(dòng)相A作為空白對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)以枸櫞酸峰計(jì)為14 514（>2 000），枸櫞酸峰拖尾因子為1.0（≤1.5），各成分基線分離良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明專屬性好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Citric acidA.Reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液0.2，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A定容，制成質(zhì)量濃度為10.11，50.56，101.12，202.24，404.48 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以枸櫞酸質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2.19×106X+4.57×103（r=0.998 0，n=5）。結(jié)果表明，枸櫞酸質(zhì)量濃度在10.11～404.48 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測(cè)限考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1 mL，加流動(dòng)相A稀釋至200 mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10∶1、3∶1時(shí)的待測(cè)成分質(zhì)量濃度分別記作定量限及檢測(cè)限。結(jié)果枸櫞酸定量限及檢測(cè)限分別為0.05 μg/mL及0.01 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為0.78%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為1.10%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（批號(hào)20191006）適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為0.64%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號(hào)20191006）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的枸櫞酸對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 耐用性試驗(yàn)

稱取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流速為0.56，0.70，0.84 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積；取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流動(dòng)相pH為5.6，7.0，8.4）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，流動(dòng)相或其流速發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the durability test

2.5 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，各批平行測(cè)定2次，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 枸櫞酸含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Tab.4 Results of content determination of citric acid in samples（n=2）

3 討論

現(xiàn)有研究對(duì)枸櫞酸含量的檢測(cè)主要集中于食品、飲料和飼料［6-11］，對(duì)于藥品中枸櫞酸的含量檢測(cè)報(bào)道較少。預(yù)試驗(yàn)中，取0.04 mg/mL過(guò)氧化碳酰胺溶液和0.50 mg/mL枸櫞酸對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外光譜（190～260 nm波長(zhǎng)）掃描，定性檢測(cè)。結(jié)果過(guò)氧化碳酰胺和枸櫞酸在190～240 nm波長(zhǎng)范圍中存在末端吸收，隨著波長(zhǎng)的增加，吸收逐漸減少，結(jié)合已有文獻(xiàn)［12-14］，選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)［15］，選擇以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫銨作為流動(dòng)相，并對(duì)流速等相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的色譜條件下，主要成分枸櫞酸與相鄰成分的色譜峰分離度良好。

綜上所述，本研究中建立了一種符合藥典相關(guān)要求，適用于藥品生產(chǎn)企業(yè)相關(guān)檢測(cè)，能有效測(cè)定過(guò)氧化碳酰胺中枸櫞酸含量的方法，并對(duì)每個(gè)參數(shù)設(shè)立了可以接受的標(biāo)準(zhǔn)和驗(yàn)證步驟。過(guò)氧化碳酰胺中枸櫞酸的含量測(cè)定，可為藥品中pH調(diào)節(jié)劑添加量的有效性和安全性提供保障。