重組人β淀粉樣蛋白1-42小規(guī)模發(fā)酵及小量純化工藝的摸索

申茉函，王全才，楊 麗

重組人β淀粉樣蛋白1-42小規(guī)模發(fā)酵及小量純化工藝的摸索

申茉函1，王全才2，楊 麗3

目的 研究重組人β淀粉樣蛋白1-42(rhAβ1-42)在5 L搖瓶中的高密度發(fā)酵實驗，以及小量純化工藝的方法。方法 分別從甲醇濃度、pH、誘導(dǎo)時間等方面對畢赤酵母重組菌株產(chǎn)生rhAβ1-42的發(fā)酵過程進行了優(yōu)化；通過硫酸銨沉淀目的蛋白、透析、脫鹽和陰離子交換層析，對rhAβ1-42小量精確的純化方法進行了研究。結(jié)果 確定rhAβ1-42在畢赤酵母中分泌表達的最佳條件為：在pH 6.0的條件下，以0.5%甲醇誘導(dǎo)72 h，經(jīng)過硫酸銨沉淀目的蛋白、透析、脫鹽和陰離子交換層析，rhAβ1-42純度可達94%以上。結(jié)論 確定了rhAβ1-42在畢赤酵母中分泌表達的最佳條件，建立了小量純化rhAβ1-42的新方法。

β淀粉樣蛋白；發(fā)酵；小量純化

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的病理特征以腦神經(jīng)細胞外出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的神經(jīng)斑或稱老年斑、腦神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)、腦皮層神經(jīng)細胞減少以及累及皮層動脈和小動脈的血管淀粉樣變性為主[1]。對β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)進行細胞學(xué)與動物實驗學(xué)的研究需要一定的蛋白作為物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于此，本研究在常規(guī)方法的基礎(chǔ)上，進一步探討了甲醇誘導(dǎo)濃度、pH值和誘導(dǎo)時間對畢赤酵母重組工程菌表達rhAβ1-42的影響，對該表達系統(tǒng)進行了小量純化方法的探索，提高了重組工程菌中rhAβ1-42的表達量。通過純化獲得高純度的rhAβ1-42，更好地滿足了研究老年性癡呆疾病細胞學(xué)和動物實驗學(xué)的需要，從而為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 畢赤酵母重組菌株(X33，pPICZα/hAβ1-42)構(gòu)建并保存;蛋白分子量Marker購自Takara Biotech公司(日本);兔抗人Aβ1-42抗體購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體購自武漢博士德公司;其余試劑均為分析純。畢赤酵母生長培養(yǎng)基包括YPD(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖)和BMGY(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽、1.34%YNB、1%甘油)。BMMY(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽、1.34%YNB、0.5%甲醇)用于誘導(dǎo)蛋白表達。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)時間對rhAβ1-42表達的影響 將重組菌株接種于生長培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。離心，收集菌體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)168 h，每24 h取樣一次。分離上清進行SDS-PAGE電泳，并測定菌體濕重。

1.2.2 pH對rhAβ1-42表達的影響 將生長培養(yǎng)基的菌體等量接入pH分別為2.2、2.8、3.4、4.0、4.6、5.2、6.0、7.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后收獲發(fā)酵液，離心取上清用于rhAβ1-42的Tricine-SDS-PAGE蛋白分析。

1.2.3 重組畢赤酵母在5 L搖瓶中的高密度發(fā)酵實驗 將凍存的工程菌在YPD瓊脂板上(含zeocin 100 μg/mL)30 ℃劃線培養(yǎng)2～3 d。挑取單克隆菌落接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h。將上述菌液接種于2L YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，OD600≈10。收集發(fā)酵液，等體積BMMY重懸細胞沉淀，甲醇誘導(dǎo)表達，在表達量達到高峰時回收上清用于純化。

1.2.4 rhAβ1-42的小量純化 甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，離心獲得發(fā)酵液上清，用H2SO4調(diào)節(jié)其pH值為5.3，取50 mL發(fā)酵上清液于4 ℃加入(NH4)2SO4進行分級沉淀，使(NH4)2SO4的飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，加入(NH4)2SO4時一定要緩慢，并且邊加邊攪拌混勻，至(NH4)2SO4完全溶解后繼續(xù)攪拌混勻，4 ℃沉淀2 h左右。取離心后的沉淀，將沉淀用100 μL包被液溶解，進行ELISA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn),40%飽和度的(NH4)2SO4沉淀中含有rhAβ1-42。

分析確定rhAβ1-42的(NH4)2SO4沉淀最佳飽和度為40%，將剩余的發(fā)酵液上清用H2SO4調(diào)節(jié)其pH值為5.3，并加入(NH4)2SO4使其飽和度為40%，重復(fù)上述40%飽和度(NH4)2SO4的純化步驟，離心收集沉淀并用10 mL PBS緩沖液(pH 7.0)溶解。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)時間對rhAβ1-42表達的影響 采用含0.5%甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 6.0)，225 r/min，30 ℃條件下對重組酵母進行誘導(dǎo)表達，不同誘導(dǎo)時間結(jié)果見圖1。甲醇誘導(dǎo)24 h，發(fā)酵液上清就可檢測到rhAβ1-42，隨著誘導(dǎo)時間增加，重組蛋白的產(chǎn)量具有累積效應(yīng)，表達72 h達到高峰。

2.2 pH對rhAβ1-42表達的影響 分別測定培養(yǎng)基pH為2.2、2.8、3.4、4.0、4.6、5.2、6.0、7.0時，rhAβ1-42產(chǎn)量的變化。在0.5%的甲醇誘導(dǎo)下，培養(yǎng)基pH為6.0時最有利于rhAβ1-42的分泌表達。見圖2。

圖1 Tricine-SDS-PAGE 篩選Aβ1-42表達的最佳時間圖譜

圖2 Tricine-SDS-PAGE確定畢赤酵母表達Aβ1-42的最佳pH值

2.3 重組畢赤酵母在5 L搖瓶中的高密度發(fā)酵實驗 將重組工程菌在上述實驗確定的最佳發(fā)酵條件(pH 6.0，甲醇濃度0.5%)下誘導(dǎo)表達，72 h收獲發(fā)酵液上清，rhAβ1-42產(chǎn)量可達150 mg/L。

2.4 rhAβ1-42的純化 rhAβ1-42的2 L搖瓶水平表達結(jié)束后立即離心分離，取上清經(jīng)飽和度20%～70%的(NH4)2SO4沉淀，通過ELISA檢測，結(jié)果顯示，(NH4)2SO4分級沉淀中40%飽和度的(NH4)2SO4沉淀中rhAβ1-42的含量最高(圖3)。粗品目的蛋白用Phamacia AKTA explorer 100 中壓液相層析系統(tǒng)純化。通過MONO Q陰離子交換層析，獲得rhAβ1-42的單一洗脫峰。

圖3 ELISA檢測確定(NH4)2SO4分級沉淀Aβ1-42最佳濃度

2.5 Western blotting分析純化rhAβ1-42不同純化階段的蛋白經(jīng)16%Tricine-SDS-PAGE分析，可見純化后的蛋白呈單一條帶，雜蛋白含量較少。rhAβ1-42產(chǎn)量約為350 mg/L，純度可達94%。Western blotting鑒定結(jié)果見圖4。

圖4 小量純化Aβ1-42 Western blotting圖

3 討論

AD由德國學(xué)者Alosi Alzheimer于1907年首次提出，Aβ蛋白是AD患者腦內(nèi)神經(jīng)炎斑的主要成分[2]。1984年，Glenner等[3]和Wong等[4]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎斑的主要成分是一種由39～43個氨基酸組成，具有β折疊構(gòu)型的蛋白，稱之為β-淀粉樣蛋白。 Aβ基因疫苗是利用合成Aβ-DNA制成。其作用機制是：該疫苗注入動物細胞后，它所含有的DNA指導(dǎo)細胞合成Aβ，機體免疫反應(yīng)促使產(chǎn)生針對Aβ的抗體，抗體進入腦內(nèi)，清除腦內(nèi)Aβ，起到治療作用。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗生成抗體需更長時間，療效相對緩和，但療效更為持久。Kima等[5]以腺病毒作為載體，攜帶編碼單核細胞集落刺激因子和Aβ的基因疫苗。集落刺激因子具有免疫調(diào)制特性，能夠高效擴大機體對抗原的免疫反應(yīng)[6]。該疫苗經(jīng)過鼻黏膜給藥免疫AD小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生以IgG為主的抗體，并且Aβ負荷明顯小于對照組。此外，Zhang等[7]利用重組腺病毒載體(AAV)在體內(nèi)表達霍亂毒素B亞基(CB)和融合蛋白，霍亂毒素B亞基無毒而且是非Thl淋巴細胞誘導(dǎo)佐荊，能夠產(chǎn)生強有力的體液免疫而不會誘發(fā)細胞免疫。試驗結(jié)果，AAV-CB-Aβ1-42疫苗1個月后即產(chǎn)生高滴度IgG抗Aβ1-42抗體，2個月后達到最高濃度，持續(xù)至少達12個月。疫苗接種2個月后，試驗組抗體滴度是重組腺病毒組Aβ1-42抗體滴度的10倍。

鑒于Aβ1-42蛋白在AD發(fā)病中和免疫療法中的重要作用，需要進一步研究Aβ1-42蛋白導(dǎo)致AD的詳細發(fā)病機制及其在免疫療法中的作用，要進行上述發(fā)病機制的研究和免疫療法的探索，就需要制備大量的Aβ1-42蛋白，但是現(xiàn)有的獲取方式主要是通過人工合成來制備蛋白，成本較高，而且生物學(xué)活性低。

畢赤酵母作為一種表達體系具有如下優(yōu)點：①含有特有的強有力的AOX1啟動子，用甲醇可以嚴(yán)格地控制外源基因的表達，當(dāng)細胞以葡萄糖、甘油、乙醇為碳源生長時，不能檢測到AOX的活性，而在甲醇培養(yǎng)的細胞中，可占細胞總蛋白的30%以上，AOX1啟動子的強誘導(dǎo)性使其下游的外源基因易于調(diào)控，并具有很高的表達率；②表達水平高，既可在胞內(nèi)表達，又可以分泌表達。已報道的畢赤酵母有最高表達量的蛋白為巴西三葉膠腈水解酶，表達量高達22 g/L[8]。絕大多數(shù)外源基因比在細菌、釀酒酵母、動物細胞中表達水平高；③發(fā)酵工藝成熟，易于放大。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，且細胞干重可達130 g/L以上，表達重組蛋白時，已經(jīng)成功放大到10 000 L；④培養(yǎng)基成分簡單，雜蛋白本底低，產(chǎn)物易于分離純化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個高效的畢赤酵母分泌表達信號肽，很多外源蛋白可在畢赤酵母中高效分泌表達，而且畢赤酵母發(fā)酵所用的培養(yǎng)基十分簡單廉價，一般為甘油或葡萄糖，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，加之畢赤酵母本身分泌的蛋白水平低，有利于下游產(chǎn)品的分離純化；⑤外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，不存在質(zhì)粒丟失問題；⑤作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪酸化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能；⑦無致病性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素等有害物質(zhì)。因此，畢赤酵母表達體系非常適合于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白[9-10]。

Subrammanian等[11]在大腸桿菌中表達合成編碼的Aβ1-42基因，并進行生產(chǎn)抗原及純化工藝。在合成的基因結(jié)構(gòu)上加了6個寡聚核苷酸，用重疊PCR的方法、采用T7啟動子進行表達重組蛋白。該重組蛋白通過單向Ni2+親和層析純化，用ELISA方法證明重組蛋白具有免疫活性。

胡海濤等[12]研究Aβ蛋白與乙型肝炎核心抗原的融合基因(HBcAg)原核表達，檢測融合蛋白的免疫反應(yīng)性及免疫原性。將重組質(zhì)粒pBV220/Aβ-HBcAg轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，調(diào)控表達，超聲破碎細菌，通過SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色和ELISA等方法，觀察Aβ-HBcAg的表達及融合蛋白的免疫反應(yīng)性。用該融合蛋白免疫Balb/c小鼠法檢測血清中抗Aβ抗體和抗HBc抗體滴度。結(jié)果提示，融合基因Aβ-HBcAg可在大腸桿菌DH5α中表達，表達蛋白有一定的免疫原性和免疫反應(yīng)性，但表達量低，免疫反應(yīng)性和免疫原性較弱。

張革等[13]在大腸桿菌中表達Aβ1-42蛋白抗原，表達量達到800 mg/L，菌液純度大于95%。方法是通過化學(xué)合成Aβ1-42基因兩個互補片段，通過PCR構(gòu)建人Aβ1-42基因，將其克隆至pGEX-T表達載體中，并進行原核表達及親和純化GST-Aβ1-42融合蛋白。結(jié)果提示，Aβ1-42在體內(nèi)能夠作為自身抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生Aβ1-42自身抗體。

Youm等[14]利用轉(zhuǎn)基因植物-馬鈴薯編碼5個串聯(lián)重復(fù)的Aβ1-42蛋白，利用ER信號肽，轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576用該馬鈴薯作為藥物飼養(yǎng)，數(shù)月后，檢測表明小鼠腦內(nèi)的Aβ1-42減少。Aβ1-42重復(fù)序列蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中得到表達并形成有免疫功能的Aβ1-42。因此，可利用這些轉(zhuǎn)基因馬鈴薯預(yù)防及治療AD，其具有一定的研究潛力。

盡管畢赤酵母在表達外源蛋白上存在諸多優(yōu)勢，但外源基因在表達過程中受自身特性和培養(yǎng)條件的影響而不穩(wěn)定[15]。本研究以甘油作為畢赤酵母擴增階段的碳源，以甲醇作為誘導(dǎo)表達階段的唯一碳源，YNB作為氮源，在30 ℃下培養(yǎng)重組酵母工程菌。分別研究pH值、甲醇含量、誘導(dǎo)時間對rhAβ1-42產(chǎn)量的影響，確定了重組工程菌分泌表達rhAβ1-42的最佳條件。對rhAβ1-42進行小量純化，因為Aβ1-42的等電點為5.31，所以本實驗首先在Aβ1-42的等電點附近用硫酸銨將目的蛋白沉淀，ELISA分析結(jié)果顯示，40%的(NH4)2SO4沉淀中rhAβ1-42的含量最高。用緩沖液溶解沉淀后進行透析脫鹽，脫鹽處理后的溶液用AKTA explorer 100中壓液相層析系統(tǒng)在pH 10.0條件下進行陰離子交換層析純化，收集洗脫峰。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示，存在相對分子量約為4 000 D的Aβ1-42蛋白，并具有生物學(xué)活性。該方法證實重組表達的hAβ1-42與天然hAβ1-42具有相同的免疫原性；該純化方法適合于小規(guī)模純化，產(chǎn)量為350 mg/L，純度可達94%。通過純化獲得高純度的rhAβ1-42，更好地滿足了研究老年性癡呆疾病細胞學(xué)和動物實驗學(xué)的需要。

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Small scale fermentation and a small purification technology of recombinant human β-amyloid peptide 1-42

SHEN Mo-han1，WANG Quan-cai2，YANG Li3

(1.Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.The People′s Hospital of Liaoning Province,Shenyang 110016,China;3.Key Laboratory of Zoonosis Research of Ministry of Education,Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To study the high-cell-density fermentation experiment of human recombinant β-amyloid protein 1-42(rhAβ1-42) in 5 L shake flask and the method of small scale purification.Methods Fermentation parameters of rhAβ1-42was further optimized mainly on concentration of methanol induction,pH value,and induced time.Secreted supernatant of rhAβ1-42was purified with ammonium sulphate sediment,dialysis desalination and anion-exchange chromatography.Results The optimal condition of rhAβ1-42expressed in Pichia pastoris was: under the condition of pH=6,induced by 0.5% methanol for 72 h,precipitation of target protein by ammonium sulfate,dialysis desalting,anion exchange chromatography,rhAβ1-42purity could reach more than 94%.Conclusion A stable fermentation and new technology of the small scale purification is successfully set up.

β-amyloid protein;Fermentation;Small scale purification

2014-09-16

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004；2.遼寧省人民醫(yī)院，沈陽 110016；3.吉林大學(xué)人獸共患研究教育部重點實驗室，長春 130021

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2004AA205020)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503003