乙型肝炎病毒c抗原特異性T細(xì)胞系的建立及CTL克隆的篩選

洪 宇

(遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，遼寧丹東 118003)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

乙型肝炎病毒c抗原特異性T細(xì)胞系的建立及CTL克隆的篩選

洪 宇

(遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，遼寧丹東 118003)

目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)抗原特異性T細(xì)胞系，并篩選得到抗原肽特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆。方法 通過流式細(xì)胞染色方法鑒定出1例急性乙型肝炎患者的人類白細(xì)胞分化抗原(HLA)為HLA-A2型，分離患者外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMCs)；用重組人HBV c抗原(HBcAg)刺激PBMCs建立抗原特異性T細(xì)胞系；用HBcAg抗原肽刺激和有限稀釋方法，篩選出HBcAg抗原肽特異性CTL克??；以固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)和乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒試驗(yàn)對(duì)HBcAg特異性T細(xì)胞系和CTL克隆進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果 建系后HBcAg特異性T細(xì)胞明顯得到富集，有限稀釋后獲得15株CTL克隆，其中14株表現(xiàn)出明顯的HBcAg抗體肽特異性，包括抗原肽Core18-27特異性CTL克隆8株，抗原肽Core107-115特異性CTL克隆4株，另外2株CTL克隆對(duì)2條HBcAg抗原肽有交叉反應(yīng)性。結(jié)論 成功建立HBcAg抗原特異性T細(xì)胞系和CTL克隆，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

肝炎病毒，乙型；T淋巴細(xì)毒，細(xì)胞毒性；T淋巴細(xì)胞；肝炎核心抗原，乙型

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的治療情況，通常取決于病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用情況。HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)是機(jī)體抵抗HBV感染，清除病毒的中堅(jiān)力量。諸多文獻(xiàn)報(bào)道乙型肝炎的慢性化與HBV特異性T細(xì)胞特別是CTL的免疫功能耗竭密切相關(guān)[1-2]。由于HBV宿主范圍狹窄，難以建立合適的HBV感染動(dòng)物模型，所以構(gòu)建HBV抗原特異性細(xì)胞系和CTL克隆成為研究病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互的重要途徑之一。另外，過繼性細(xì)胞免疫治療的設(shè)想被提出[3-4]，也賦予HBV抗原特異性CTL克隆尤其是具備優(yōu)勢(shì)抗原表位的CTL克隆極具潛力的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究通過重組人乙型肝炎核心抗原(HBcAg)及HBcAg抗原肽刺激急性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，建立HBcAg特異性T細(xì)胞系和CTL克隆，并對(duì)細(xì)胞系和細(xì)胞克隆進(jìn)行了初步功能鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺購自美國(guó)Invitrogen公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自AXIS-SHIELD公司；重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)、重組人白介素-7(rhIL-7)購自R&D公司；植物血凝素(PHA)購自Sigma公司；重組乙型肝炎核心抗原(rHBcAg)購自Prospec公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒檢測(cè)試劑盒購自Promega公司；固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)試劑盒購自U-Cytech公司；鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD4-APC熒光抗體均購自BD公司；HBcAg抗原肽(Core 18-27:FLPSDFFPSI，Core 107-115:CLTFGRETV)由上海生工生物工程公司合成，純度大于95%；流式細(xì)胞儀FACS Calibur購自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMCs的制備 血標(biāo)本來自1名26歲男性急性乙型肝炎患者，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì) 2000 年聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》[5]?；颊卟裳獣r(shí)血清指標(biāo)：HBsAg(+)、HBsAb(-)、HBeAg(-)、HBeAb(+)、HBcAb(+)、HBcAb-IgM(+)、HBV DNA(<500 copies/mL)；血清抗 HAV-IgM、抗 HCV、抗 HEV及抗 HIV 檢測(cè)均為陰性。經(jīng)患者知情同意后，無菌采集靜脈血10 mL，加等量RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋混勻，緩慢疊加至淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min 離心20 min，收集 PBMCs 層。以RPMI-1640培養(yǎng)液重復(fù)洗滌3次，調(diào)整 PBMCs 濃度至 2×106個(gè)/mL，混懸于含10% 胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。

1.2.2 人類白細(xì)胞抗原A2陽性(HLA-A2)分型 取抗凝外周血50 μL加入1 μL 鼠抗人HLA-A2-PE抗體或同型對(duì)照抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光孵育10 min，離心后PBS洗滌2次，細(xì)胞重懸于200 μL PBS中上FACS Callibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 HBcAg特異性CD8+T細(xì)胞系的建立 向濃度為2×106個(gè)/mL 的PBMCs中加入終濃度1 μg/mL 的rHBcAg及終濃度2 mmol/L-谷氨酰胺，于24孔培養(yǎng)板中在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。試驗(yàn)第4天離心細(xì)胞換液至新鮮含2 mmol/L谷氨酰胺、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并加入rhIL-2至終濃度12 U/mL；第7、10天分別換液，培養(yǎng)至2周。

1.2.4 ELISPOT法鑒定HBcAg特異性T細(xì)胞系 嚴(yán)格按照UCytech公司IFN-γ 細(xì)胞因子ELISPOT試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要步驟如下：溶解包被抗體，預(yù)先包被于96孔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；每孔加入3×105個(gè)PBMCs細(xì)胞，同時(shí)加入HBsAg(10 ng/μL)，設(shè)立不加任何抗原的空白對(duì)照和加PHA的陽性對(duì)照，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，洗滌后加入生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗生物素抗體，37 ℃孵育1 h，洗滌后再加入AEC顯色底物，室溫孵育30 min后，可見紫色斑點(diǎn)，其中一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)能夠產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞。晾干PVDF膜后，經(jīng)自動(dòng)ELISPOT分析儀讀取斑點(diǎn)數(shù)目。

1.2.5 HBcAg抗原肽特異性CTL克隆的篩選 將上述T細(xì)胞系加入混合后的2條抗原肽(終濃度10 μg/mL)及異體飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后換液至含IL-2(終濃度12 U/mL)、IL-7(終濃度5 ng/mL)、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，再培養(yǎng)5 d，如此7 d為一個(gè)循環(huán)；培養(yǎng)2個(gè)循環(huán)后，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆。有限稀釋時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液為含rhIL-2(50 U/mL)、rhIL-7(25 ng/mL)、PHA(1 μg/mL)、10%FBS和異體飼養(yǎng)細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)的RPMI-1640培養(yǎng)液。根據(jù)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況加入刺激物、換液及擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.6 抗原特異性CTL克隆的純度鑒定 細(xì)胞克隆長(zhǎng)成后，取少量細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌1次，與鼠抗人CD3FITC/ CD8-PE/CD4-APC 熒光抗體室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸于200 μL PBS中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.7 抗原肽特異性CTL克隆功能測(cè)定 采用EB病毒誘導(dǎo)的方法建立同一患者B淋巴母細(xì)胞系，建系方法參考文獻(xiàn)[6]。B淋巴母細(xì)胞系在含HBcAg抗原肽(終濃度10 μg/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，洗去游離抗原肽后，即為靶細(xì)胞。將CTL克隆與靶細(xì)胞按效靶比2∶1和5∶1混合(總體系200 μL)，種于96孔U底板，低速離心后在37 ℃、5%CO2條件下孵育 4 h，取上清液50 μL加LDH基質(zhì)液50 μL，混勻后室溫避光育30 min，加中止液后用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)490 nm 吸光度值(OD490)。計(jì)算公式：細(xì)胞毒活性(%)=(試驗(yàn)孔OD490-CTL細(xì)胞自發(fā)釋放孔OD490-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔OD490)/(靶細(xì)胞最大釋放孔OD490-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔OD490)×100%。

2 結(jié)果

2.1 HBcAg特異性CD8+T細(xì)胞系的建立 通過ELISPOT法，抗原特異性T細(xì)胞在經(jīng)過HBcAg刺激后會(huì)分泌IFN-γ，被特異性抗IFN-γ捕獲后經(jīng)染色可形成肉眼可見的斑點(diǎn)，見圖1。建系前每3×105個(gè)PBMCs中含HBcAg抗原特異性T細(xì)胞9個(gè)，建系后每3×105個(gè)PBMCs中含HBcAg抗原特異性T細(xì)胞85個(gè)，建立細(xì)胞系的過程使HBcAg抗原特異性T細(xì)胞得到極大的擴(kuò)增。

圖1 建系前后HBcAg特異性T細(xì)胞的檢測(cè)

2.2 HBcAg抗原肽特異性CTL克隆細(xì)胞純度的測(cè)定 用2條抗原肽刺激T細(xì)胞系，再經(jīng)過有限稀釋，共獲得15株CTL克隆。經(jīng)熒光抗體染色后分析細(xì)胞純度發(fā)現(xiàn)15個(gè)克隆細(xì)胞均為CD3+/CD8+/CD4-T細(xì)胞株，其中CD3分子的表達(dá)率大于90%，CD8分子的表達(dá)率大于85%，PBMCs和抗原特異性CTL純度鑒定的代表圖見圖2。

2.3 HBcAg抗原肽特異性CTL克隆細(xì)胞毒活性測(cè)定 采用LDH釋放試驗(yàn)測(cè)定HBcAg抗原肽特異性CTL細(xì)胞毒活性(表1)，結(jié)果顯示：15 個(gè)克隆株中的14個(gè)具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性，包括抗原肽Core18-27特異性CTL克隆8株(1B3，1D9，1F2，2B3，2D2，3B10，3D6，3E4)，抗原肽Core107-115特異性CTL克隆4株(1B5，1C4，2E2，2F8)，對(duì)2條HBcAg抗原肽有交叉反應(yīng)性克隆2株(2E5，3B5)，僅1株克隆(2C11)未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒活性。且當(dāng)效靶比增加時(shí)，各CTL克隆的細(xì)胞毒活性亦相應(yīng)增強(qiáng)。而未加特異性抗原肽的B細(xì)胞系作靶細(xì)胞檢測(cè)不出細(xì)胞毒活性，說明本試驗(yàn)的特異性非常可靠。

圖2 PBMCs和抗原特異性CTL中CD3+/CD8+細(xì)胞染色示例圖

表1 HBcAg抗原肽特異性CTL克隆細(xì)胞毒活性測(cè)定(%)

3 討論

急性肝炎患者體內(nèi)可產(chǎn)生較強(qiáng)的、針對(duì)HBV多個(gè)抗原不同表位的多克隆特異性CTL細(xì)胞應(yīng)答，而慢性HBV感染者的特異性CTL應(yīng)答則較弱，機(jī)體對(duì)病毒呈免疫耐受或部分免疫耐受狀態(tài)[7]。病毒特異性CTL對(duì)HBV感染的結(jié)局有至關(guān)重要的影響，文獻(xiàn)用敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除CD8+T細(xì)胞的小鼠無法最終清除病毒[8]。HBcAg特異性CTL是患者病毒特異性CTL的一個(gè)重要組成部分，由于HBcAg一般在血清中不會(huì)游離存在，避免大量游離抗原對(duì)HBcAg特異性CTL的消耗，而且HBcAg常被感染的肝細(xì)胞提呈，使得HBcAg特異性CTL成為機(jī)體清除HBV及HBV感染肝細(xì)胞的重要力量，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。

通過HBcAg刺激急性乙肝患者PBMCs，再用IL-2擴(kuò)增細(xì)胞構(gòu)建抗原特異性T細(xì)胞系。在HBcAg刺激PBMCs過程中，PBMCs中的單核細(xì)胞、DC等抗原提呈細(xì)胞對(duì)HBcAg進(jìn)行吞噬和加工，再通過MHC分子提呈給T細(xì)胞，提供T細(xì)胞第一活化信號(hào)；抗原提呈的時(shí)候，單核細(xì)胞或DC細(xì)胞會(huì)同時(shí)上調(diào)B7分子，與T細(xì)胞上CD28結(jié)合，提供T細(xì)胞第二活化信號(hào)。經(jīng)過第一、第二信號(hào)活化的T細(xì)胞獲得了增殖能力，在IL-2作用下，可呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。而其他的非HBcAg特異性T細(xì)胞則不會(huì)增殖，從而使得抗原特異性T細(xì)胞在建系過程中得到富集。在本試驗(yàn)中，建系前每3×105個(gè)PBMCs含9個(gè)抗原特異性T細(xì)胞，建系后這一數(shù)目擴(kuò)增至85個(gè)，HBcAg特異性T細(xì)胞得到極大的富集。

利用建系過程對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增，再用ELISPOT法檢測(cè)特異性抗原刺激下分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)目，是研究慢性乙肝患者抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的有效方法之一。由于慢性乙肝患者特異性T細(xì)胞數(shù)量極少，用直接ELISPOT或HBV抗原肽五聚體方法常難以檢測(cè)到，用建系的方法對(duì)抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增后再行檢測(cè)，成為測(cè)量慢性乙肝患者細(xì)胞免疫功能更實(shí)用的技術(shù)手段。文獻(xiàn)即用此方法發(fā)現(xiàn)在年輕的免疫耐受期慢性乙肝患者體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞依然保持功能完整[10]。除此之外，抗原特異性T細(xì)胞系還可以用來制備抗原肽特異性CTL克隆。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[7]合成2條T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位抗原肽，通過HBcAg抗原肽刺激T細(xì)胞系，再用IL-2/IL-7聯(lián)合擴(kuò)增抗原肽特異性CTL克隆。由于IL-7是擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞較特異性細(xì)胞因子，因此本研究未像其他研究加入抗CD4抗體殺滅CD4+T細(xì)胞，因?yàn)樯倭緾D4+T細(xì)胞的存在對(duì)CD8+T細(xì)胞的增殖和分化具有輔助作用[11-12]。通過有限稀釋方法篩選HBcAg抗原肽刺激后的T細(xì)胞系，本研究最終獲得15株CTL克隆，用流式染色方法分析細(xì)胞克隆純度發(fā)現(xiàn)所有CTL克隆均為CD3+CD8+T細(xì)胞克??；用細(xì)胞毒試驗(yàn)驗(yàn)證CTL的特異性發(fā)現(xiàn)，14株CTL克隆表現(xiàn)出對(duì)荷肽靶細(xì)胞特異性殺傷能力，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。

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洪宇(1975-)，講師，碩士，主要從事病原生物學(xué)、免疫學(xué)分析方向研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.02.037

R373.2

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1671-8348(2015)02-0248-03

2014-08-05

2014-10-19)