黃芪及其提取物對(duì)矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響*

顏春魯，陳 麗，胡繼宏，岳 嘉，張書楠，慕婷婷，朱俊燚，雒志義

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2天津中醫(yī)藥大學(xué)

黃芪及其提取物對(duì)矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響*

顏春魯1，2，陳 麗1△，胡繼宏1，岳 嘉1，張書楠1，慕婷婷1，朱俊燚1，雒志義1

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2天津中醫(yī)藥大學(xué)

目的：觀察黃芪及其提取物對(duì)矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchi al al veol us fl ui d，BA LF)M M P-2和M M P-9表達(dá)的影響，探討黃芪抑制矽肺纖維化的作用機(jī)制。方法:SPF級(jí)W i st ar雄性大鼠120只，隨機(jī)分為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組、黃芪水煎液組、黃芪總苷組、黃芪多糖組，每組20只。大鼠水合氯醛麻醉后，采用經(jīng)氣管染Si O2粉塵法復(fù)制矽肺模型。干預(yù)組注入Si O2粉塵后1d開始用黃芪提取物及黃芪總苷灌胃，正常組及模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。觀察各組肺組織病理改變，行支氣管肺泡灌洗術(shù)，用ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液M M P-2及M M P-9的表達(dá)。結(jié)果：各時(shí)段模型組M M P-2和M M P-9表達(dá)較正常組均降低(P＜0.05)，而乙酰半胱胺酸組、黃芪各干預(yù)組各時(shí)段表達(dá)均低于模型組，在28天M M P-2和M M P-9表達(dá)均下降(P＜0.05)。結(jié)論：黃芪能降低矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液M M P-2、M M P-9的表達(dá)，這可能是其抑制矽肺纖維化形成的機(jī)制之一。

黃芪；矽肺；M M P-2；M M P-9

肺纖維化效應(yīng)細(xì)胞分泌的生物活性分子基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)在細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的合成和降解中具有重要意義。而在MMP家族中，MMP-2和MMP-9的特異性底物是IV型膠原，同時(shí)IV型膠原是肺泡壁基底膜的重要成分。肺間質(zhì)纖維化過程中很重要的部分即肺泡上皮細(xì)胞和基底膜的損傷［1］。筆者用黃芪及其提取物治療SiO2所致矽肺纖維化，在肺纖維化形成過程中的不同階段提取支氣管肺泡灌洗液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而對(duì)黃芪治療矽肺的機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠120只，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXZ(甘)2011-0001-0001302)，體質(zhì)量180～220 g。隨機(jī)分為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組、黃芪水煎液組、黃芪總苷組和黃芪多糖組，每組20只大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 SiO2粉塵(Sigma公司，純度99%，粒子直徑在0.5～1.0 μm，80%粒子在1～5 μm)；黃芪水煎液(甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心制作)；黃芪總苷(AST)(南京光潤(rùn)生物制品有限公司生產(chǎn)，批號(hào)GR20120920AS2)；乙酰半胱氨酸泡騰片(富露施，注冊(cè)證號(hào)H20090620)；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130608B)；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130608B)。

1.3 儀器 MOD-EL680型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國(guó)伯樂公司提供)；BL121SS型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)；GL-20A全自動(dòng)冷凍高速離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠提供)；721分光光度計(jì)(上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠提供)；BX41顯微鏡系統(tǒng)(日本奧林巴斯)等。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠水合氯醛麻醉后，采用經(jīng)氣管染SiO2粉塵法復(fù)制矽肺模型。各干預(yù)組注入SiO2粉塵后1天開始用藥物灌胃，正常組及模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.4.2 給藥 黃芪水煎液組給藥量：20 g/kg，黃芪總苷(AST)給藥量：20 mg/kg，黃芪多糖給藥量：40mg/kg，乙酰半胱氨酸泡騰片給藥量：200mg/kg。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo) 第7、14、28天分批處死大鼠，觀察肺組織病理改變，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液 MMP-2和MMP-9活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果采用(±s)表示，用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài) 大鼠造模后飲水和飲食均恢復(fù)，但模型組有個(gè)別大鼠精神不振。隨后觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠飲水、飲食及精神均正常；而模型組與其他各個(gè)干預(yù)組均發(fā)現(xiàn)大鼠飲水及飲食明顯減少，精神狀態(tài)差，對(duì)刺激的反應(yīng)較遲鈍，嗜睡，毛發(fā)蓬松，色晦暗。

2.2 肺臟外觀肉眼觀察 正常組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組第7天可見大鼠雙肺呈鮮紅色，有散在出血點(diǎn)，體積增大，第14天兩肺處顯暗紅色陳舊出血，第28天可見雙肺蒼白、體積較小、彈性差、硬度增加、表面凸凹不平。各干預(yù)組和模型組病變基本一致，但程度較輕。

2.3 H E染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 黃芪水煎液組在28天可見炎癥改變，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔和肺間質(zhì)可見含塵巨噬細(xì)胞灶，肺泡融合呈不同程度肺氣腫改變；矽肺模型組28天有肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并有明顯矽結(jié)節(jié)出現(xiàn)，見圖1。

圖1 黃芪水煎液組與模型組第28天肺組織比較(H E染色，×400)

2.4 支氣管肺泡灌洗液M M P-2和M M P-9表達(dá)的檢測(cè) 不同時(shí)期模型組與正常組MMP-2表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而乙酰半胱氨酸組MMP-2 (7、14、28天)表達(dá)較同期模型組下降(P＜0.05)，黃芪水煎液組、黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-2表達(dá)與模型組比較均下降(P＜0.05)，各干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。不同時(shí)期模型組與正常組MMP-9表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。乙酰半胱氨酸組和黃芪水煎液組MMP-9在14天、28天表達(dá)較同期模型組下降(P＜0.05)，黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-9表達(dá)與模型組比較均下降(P＜0.05)，黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-9表達(dá)與模型組比較亦下降(P＜0.05)，各干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表1 大鼠BA LF M M P-2的動(dòng)態(tài)變化 ng/m L

表2 大鼠BA LF M M P-9的動(dòng)態(tài)變化 ng/m L

3 討論

目前較公認(rèn)的矽肺發(fā)病機(jī)制是肺部持續(xù)性的炎癥反應(yīng)與纖維化反應(yīng)交織進(jìn)行的不可逆過程，早期以炎癥反應(yīng)為主，晚期以肺纖維化為主［2］。我們通過氣管注射二氧化硅粉塵懸液，使大鼠肺組織發(fā)生改變，建立矽肺模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模大鼠均有不同程度的活動(dòng)減少、嗜睡、少吃等癥狀。通過觀察其病理變化，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在第28天有明顯矽結(jié)節(jié)形成，而黃芪水煎液組大鼠肺臟同期雖有炎性反應(yīng)和纖維化的形成，但病變程度較輕，說明黃芪可減輕和緩解矽肺纖維化的進(jìn)程。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作為一組細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)的代謝，對(duì)肺間質(zhì)纖維化的病理過程有非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在矽肺發(fā)生的早期，即肺泡炎階段MMP-2、MMP-9的表達(dá)會(huì)明顯增加，而在矽肺形成的后期MMP-2、MMP-9雖然較早期有所下降，但仍然表達(dá)很高。這說明在肺損傷過程中細(xì)胞基質(zhì)的代謝非?；钴S。細(xì)胞基質(zhì)代謝紊亂與矽肺纖維化形成有關(guān)。在肺纖維化形成的過程中，總的基質(zhì)金屬蛋白酶在矽肺發(fā)生階段會(huì)參與細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜的降解，而在修復(fù)階段能夠調(diào)節(jié)肺組織的重塑［3］。

中藥黃芪生用有益氣固表、利水消腫、托毒生肌功效，蜜炙黃芪有補(bǔ)氣、養(yǎng)血、益中功效［4］，臨床常用于矽肺的治療。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，模型組與各干預(yù)組MMP-2和MMP-9在第7天時(shí)表達(dá)最高，然后均逐漸下降，但各干預(yù)組下降較快，到第28天時(shí)MMP-2和MMP-9水平均基本接近正常，其中乙酰半胱氨酸組下降最為明顯。MMP-2能通過分解Ⅳ型膠原蛋白及糖蛋白成分使肺基質(zhì)成分降解，破壞肺泡壁結(jié)構(gòu)的完整性，從而使成纖維細(xì)胞遷移到肺泡腔，造成肺泡腔內(nèi)纖維化［5］。第28天MMP-2在黃芪各干預(yù)組的表達(dá)低于模型組，提示黃芪通過抑制MMP-2表達(dá)，從而延緩或抑制肺纖維化。肺纖維化大鼠在造模前14天以肺泡炎的病理改變?yōu)橹鳎醒芯空J(rèn)為MMP-9可能與早期上皮基底膜損傷有關(guān)，參與了細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解［6］。黃芪水煎液組與乙酰半胱氨酸組的MMP-9明顯下降，且在第14天時(shí)MMP-9的表達(dá)均明顯低于模型組，推測(cè)黃芪與乙酰半胱氨酸可能是通過抑制MMP-9表達(dá)，從而延緩、減輕早期肺泡炎的發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SiO2誘導(dǎo)的矽肺模型在不同時(shí)期MMPs的表達(dá)不同，以MMP-2和MMP-9增加為主，與有關(guān)報(bào)道一致，黃芪水煎液及其提取物可能通過抑制MMP-9在肺纖維化大鼠肺內(nèi)的表達(dá)，減輕早期的肺泡炎，抑制MMP-2的表達(dá)，延緩和抑制后期肺纖維化的發(fā)生。

［1］ Tom ohi t o G，H i rom i chi G，M i t suo T，et al. Rel at i onshi p bet w een abdom i nalfat accum ul at i on and i nsul i n resi st ance i n hem odi al ysi s pat i ent［J］.H ypert en Res，2008，32(1)：83-88.

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Influence of HuangQi and Its Extractive on the Expressions of MMP-2 and MMP-9 in Bronchial Alveolus Lavage Fluid of Rat Model with Silicosis

YAN Chunlu1,2,CHEN Li1△,HU Jihong1,YUE Jia1,ZHANG Shunan1,MU Tingting1,ZHU Junyi1,LUO Zhiyi1
1 Key Laboratory of Education Ministry Dunhuang Medicine and Translation from Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of HuangQi(radix astragali)inhibiting silicosis by observing the influence of HuangQi and its extractive on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in bronchial alveolus fluid (BALF)of rat model with silicosis.Methods:Altogether 120 SPF rats were randomized into the normal group,the model group,acetylcysteine group,HuangQi decoction group,total glycosides(TG)group of HuangQi and astragalus polysaccharides(APS)group,20 rats each group.Rat model with silicosis were duplicated by SiO2dust dyeing method through air tube after the rats accepted anaesthesia with chloral hydrate.The intervention group accepted intragastric administration of HuangQi extractive and HuangQi TG in one day after injecting SiO2dust,the normal group and the model group accepted intragastric administration of physiological saline in the same volumes.Pathological changes of pulmonary tissue were observed in different groups and bronchoalveolar lavage was performed, the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF were detected by ELISA method.Results:The expressions of MMP-2 and MMP-9 of the model group were lower compared with the normal group in different times(P＜0.05), while the expressions were lower in acetylcysteine group and HuangQi intervention groups in different times,the expressions of MMP-2 and MMP-9 were decreased at 28 days(P＜0.05).Conclusion:HuangQi could decrease the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF of rat model with silicosis,and it might be one of the mechanisms of inhibiting silicosis.

HuangQi;silicosis;MMP-2;MMP-9

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0022-03

2014-12-27

敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(編號(hào)D H Y X 1213-002)；甘肅省教育廳第二批科研項(xiàng)目計(jì)劃(編號(hào)1106B-05)；甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年基金項(xiàng)目(編號(hào)BH 2011-0020)。

顏春魯(1979—)，男，碩士學(xué)位，講師。研究方向：骨傷疾病的中醫(yī)藥防治。

△通訊作者：陳麗(1981—)，女，碩士學(xué)位，講師。研究方向：心血管與呼吸系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治。