腫瘤原代培養(yǎng)物免疫熒光染色法評價化療藥物選擇性的研究

姜偉，黃文芳，Lan kiuwe，Victor-F.Mautner，ReinnardE.Driedrich

腫瘤原代培養(yǎng)物免疫熒光染色法評價化療藥物選擇性的研究

姜偉，黃文芳，Lan kiuwe1，Victor-F.Mautner1，ReinnardE.Driedrich2

（四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川成都610072；漢堡大學醫(yī)學中心：1神經(jīng)內科；2口腔頜面外科）

目的：探索建立基于腫瘤原代培養(yǎng)物免疫熒光染色評價化療物選擇性和特異性的新方法。方法：利用手術切除的叢狀神經(jīng)纖維瘤（PNF）組織，混合培養(yǎng)原代腫瘤細胞和非腫瘤細胞并使用尼羅替尼（Nilotinib）和伊馬替尼（Imatinib）進行處理，測定細胞增殖和毒性。利用特異性免疫熒光抗體染色處理后的細胞，通過ImageJ軟件計數(shù)腫瘤細胞和非腫瘤細胞并計算兩者比例變化，評價藥物效能。結果：藥物處理后，細胞增殖的降低和毒性的增加與藥物濃度成正比。熒光細胞計數(shù)顯示腫瘤細胞和非腫瘤細胞數(shù)量在藥物處理后均減少，但藥物效能具有個體差異性。結論：利用特異性免疫熒光染色計數(shù)同一組織混合培養(yǎng)的腫瘤細胞和非腫瘤細胞在藥物處理后比例變化，可以評價化療藥物的選擇性和特異性。

原代培養(yǎng)；免疫熒光染色；化療藥物；個體化治療

個體化治療（Individualized therapy）是目前臨床腫瘤治療研究的一大熱點，其中探索建立快速、準確的體外藥敏試驗是重要研究方向之一[1，2]。利用原代培養(yǎng)腫瘤細胞在治療前或治療過程中進行藥敏試驗，可以篩選出敏感性較強的化療藥物，對于制訂個體化化療策略有著十分重要的意義[3]。本研究通過特異性免疫熒光抗體染色化療藥物處理后的腫瘤原代混合培養(yǎng)物，計數(shù)腫瘤細胞和非腫瘤細胞的比例變化，以評價化療藥物有效性及其治療指數(shù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

病理明確診斷的叢狀神經(jīng)纖維瘤（PNF）組織樣本來自于2014年01月至12月漢堡大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科和口腔頜面外科患者11例，其中男性6例，女性5例，年齡14～52歲，平均（36±11）歲。研究內容經(jīng)學術倫理委員會審核（批準號：OB-061/05），患者知悉組織標本的使用并簽署知情同意書。所有腫瘤組織在手術切除后放于Hanks平衡鹽溶液（Sigma公司）中，其中部分組織凍存于液氮，剩余的組織用于Schwann細胞（腫瘤細胞）和成纖維細胞（非腫瘤細胞）混合培養(yǎng)。

1.2 主要儀器及設備

磷酸鹽緩沖液、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素、鼠層粘連蛋白、多聚賴氨酸、2-巰基乙醇（Gibco公司）；二甲基亞砜、胰島素、多聚甲醛、3-異丁基-L-甲基黃嘌呤（IBMX）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、100μm不銹鋼網(wǎng)篩（Sigma公司）；兔抗人類S100抗體、FITC結合的抗兔抗體（二抗）、抗成纖維細胞抗體（CD90），F(xiàn)ITC結合羊抗鼠IgG（二抗）、碘化丙啶（DAKO公司）；尼羅替尼、伊馬替尼（Novartis公司）；谷氨酰胺、丙酮酸鈉（Biochrom公司）；膠原酶和中性蛋白酶（Roche公司）；Heregulin（rHRG-h1177–244，Genentech公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；熒光顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織消化

手術切除的PNF組織放入無菌磷酸鹽緩沖溶液中，去除脂肪和結締組織后，將腫瘤組織切成2～3 mm大小，置于基礎培養(yǎng)液（包括DMEM 500 mL、10% FBS、500 U/mL的青霉素和鏈霉素、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸鈉），37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，然后使用含有0.5 mg/mL膠原酶和分散酶的基礎培養(yǎng)液消化組織。24 h后，利用100μm不銹鋼網(wǎng)篩分離未消化組織，1 500 rpm/min離心5 min，棄去上清后的沉淀物為原代細胞。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

對于培養(yǎng)Schwann細胞，培養(yǎng)表面預先使用0.01%多聚賴氨酸和4μM層粘連蛋白包被。Schwann細胞選擇性培養(yǎng)液包括基礎培養(yǎng)液、0.5 mM IBMX、2 nM heregulin、2.5 mM胰島素。成纖維細胞的培養(yǎng)采用基礎培養(yǎng)液加0.1 mM 2-巰基乙醇。根據(jù)細胞的生長情況，每3～5 d換一次培養(yǎng)液。細胞傳代使用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化[4]，取3～5代細胞進行實驗分析。

1.3.3 藥物處理

分別配制含有0、5、10、20μM尼羅替尼和0、10、20、40μM伊馬替尼的細胞培養(yǎng)液。對于處理中的細胞，每天更換含有藥物的培養(yǎng)液，處理時間為5 d。

1.3.4 細胞增殖和毒性檢測

利用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集貼壁生長的Schwann細胞和成纖維細胞，培養(yǎng)于96孔平板中，每孔500個細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨后開始藥物處理，5 d后分別使用Cell Proliferation BrdU ELISA和LDH活性檢測試劑盒（Roche公司，德國）測定細胞增殖和毒性指標。每個藥物處理濃度重復6孔，計算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）和半數(shù)毒性濃度（CC50）。

1.3.5 免疫熒光抗體染色

細胞收集后培養(yǎng)于8孔細胞培養(yǎng)載玻片（BD公司，德國），10 000個細胞每孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。藥物處理5 d后，棄去培養(yǎng)液用冷PBS洗滌細胞兩次，然后使用4%多聚甲醛對細胞進行固定。對于Schwann細胞的染色，采用兔抗人類S100抗體和FITC結合的抗兔抗體（綠色熒光）；而成纖維細胞染色采用抗成纖維細胞抗體（CD90）和FITC結合的羊抗鼠IgG抗體（紅色熒光）進行染色；應用碘化丙啶染色細胞核，使其呈藍色[5]。

1.3.6 免疫熒光細胞計數(shù)

應用熒光顯微鏡對染色細胞進行觀察并采集圖片，利用ImageJ軟件（National Institutes of Health，美國）對圖片進行處理和自動計數(shù)細胞，每個藥物濃度計數(shù)200個細胞，重復4次取平均值，計算Schwann細胞與成纖維細胞的比例。對于未著色的細胞不進行計數(shù)。

2 結果

2.1 細胞增殖和毒性結果

尼羅替尼和伊馬替尼均能抑制細胞的增殖，抑制效果與藥物的濃度成正比。同時，兩種藥物可增加細胞毒性，其毒性作用大小與藥物的濃度成正比。尼羅替尼的IC50和CC50分布為4～9μM和9～21μM，遠低于伊馬替尼的10～21μM和30～58μM（表1）。

表1 尼羅替尼和伊馬替尼處理后細胞增殖和毒性結果

2.2 免疫熒光染色結果

特異性免疫熒光染色將Schwann細胞（圖1A，圖1C、圖1G）和成纖維細胞（圖1B、圖1D、圖1G）胞漿分別染成綠色和紅色，細胞核則呈藍色。在藥物處理后，細胞數(shù)量均減少（圖1C、圖1D），減少的程度與藥物濃度相關。獲取熒光染色圖片后，利用ImageJ軟件處理并計數(shù)Schwann細胞和成纖維細胞數(shù)量（圖1E、圖1F）。部分細胞對兩種特異性抗體無反應，胞漿無著色而細胞核染成藍色（圖1G），這類細胞不納入計數(shù)。

2.3 腫瘤細胞和非腫瘤細胞比例變化

通過計數(shù)S100陽性和CD90陽性細胞，統(tǒng)計各藥物處理濃度下的Schwann細胞和成纖維細胞的數(shù)量并計算兩者比例變化情況（圖2）。結果顯示細胞比例變化與藥物劑量相關，但是變化的模式存在腫瘤個體差異性。在腫瘤樣本T2344、T2373、T2382（圖2A、圖2B）中，兩種藥物均顯示了良好的作用效果，表現(xiàn)為有效、持續(xù)地抑制腫瘤細胞增殖，而對非腫瘤細胞影響較?。粚τ谀[瘤樣本T2343、T2345、T2346、T2347、T2385（圖2C、圖2D），尼羅替尼可持續(xù)而有效地抑制腫瘤細胞增殖，而對非腫瘤細胞損傷較小，而伊馬替尼對兩種細胞的增殖均產(chǎn)生抑制作用，因此尼羅替尼的選擇性抑制作用優(yōu)于伊馬替尼；而在腫瘤樣本T2392（圖2E，圖2F）中，伊馬替尼作用效果優(yōu)于尼羅替尼；剩下的兩例腫瘤樣本T2384和T2390（圖2G、圖2H），兩種藥物的作用效果均較差。

圖1 藥物處理前后細胞特異性免疫熒光抗體染色

圖2 化療藥物處理前后的細胞比例變化

3 討論

由于缺乏客觀、有效的實驗檢測手段，臨床很難評估抗腫瘤藥物的選擇性和特異性，從而造成化療效率不高、毒副反應大、選擇性差和耐藥等問題[6]?；熕幬矬w外篩選技術是從數(shù)量龐大的候選化合物中經(jīng)濟、快速、高效的篩選理想抗腫瘤藥物的重要手段[7]。

前期的研究證實了同一PNF組織的混合培養(yǎng)物中，Schwann細胞存在基因突變——雜合性缺失（LOH），為腫瘤細胞，而成纖維細胞則無此突變，為非腫瘤細胞[8]。利用PNF原代混合培養(yǎng)物進行體外藥物篩選實驗，可以評價化療藥物的治療效果[5，9]。本研究在前期研究基礎上進行了改進，通過在相同實驗條件下，同時檢測藥物對混合培養(yǎng)物中的腫瘤細胞和非腫瘤細胞的抑制及損傷效果，來評價化療藥物的有效性和特異性，以及藥物的治療指數(shù)。實驗結果表明化療藥物的作用效能具有明顯的腫瘤個體差異性，與前期相關腫瘤藥物治療效果評價的體外和體內實驗結果一致。本研究所建立的基于腫瘤原代培養(yǎng)物免疫熒光染色法評價化療物選擇性的實驗方案，可為體外篩選能夠特異的抑制腫瘤細胞生長，而對非腫瘤細胞損傷較小的化療藥物，以及確定藥物的治療指數(shù)。如果將藥物處理濃度控制在IC50和CC50之間，可保持較好的腫瘤細胞殺傷作用，而對非腫瘤細胞損傷較輕，可減少副反應的發(fā)生。該方法為臨床化療藥物效能評價和抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的客觀的實驗室檢測手段，在臨床腫瘤的個體化治療中具有重要價值。

但是，本研究采用細胞特異的熒光抗體染色來區(qū)分腫瘤細胞和非腫瘤細胞，具有一定的局限性，受到操作人員技術、熒光染色效果等因素的影響。顯微鏡下獲取的局部染色細胞圖像，也不能完全反映該藥物處理條件下的全部細胞特性。此外，本方案也只能用于原代培養(yǎng)物中的腫瘤細胞和非腫瘤細胞為不同細胞類型的腫瘤。

總之，利用同一腫瘤組織來源的原代細胞混合培養(yǎng)物，來評價化療藥物的選擇性和特異性是可行的。通過檢測混合培養(yǎng)物中腫瘤細胞和非腫瘤細胞，在不同藥物及其不同濃度處理后的比例改變情況，能夠評估化療藥物的選擇性和特異性，可為臨床制訂有效的個體化化療策略提供幫助。

1.Brugts JJ.Optimizing treatment benefit:individualized therapy or the polypill[J].Nat Rev Cardiol，2014，11(5): 307.

2.Eisenstein M.Personalized medicine:Special treatment[J]. Nature，2014，513(7517):S8-9.

3.朱勝章，陸建波.腫瘤細胞原代培養(yǎng)的應用于發(fā)展[J].腫瘤基礎與臨床，2012，25(1):89-92.

4.Demestre M，Herzberg J，Holtkamp N，et al.Imatinib mesylate(Glivec)inhibits Schwann cell viability and reduces the size of human plexiform neurofibroma in a xenograft model[J].J Neurooncol，2010，98(1):11-19.

5.Jiang W，Schnabel C，Spyra M，et al.Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro[J].J Neurooncol，2014，116(2):231-236.

6.Hole S，Pedersen AM，Hansen SK，et al.New cell culture model for aromatase inhibitor-resistant breast cancer shows sensitivity to fulvestrant treatment and cross-resistance between letrozole and exemestane[J].Int J Oncol，2015，46(4):1481-1490.

7.Lovitt CJ，Shelper TB，Avery VM.Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery[J].Biology，2014，3 (2):345-367.

8.Kluwe L，F(xiàn)riedrich R，Mautner VF.Loss of NF1 allele in Schwann cells but not in fibroblasts derived from an NF1-associated neurofibroma[J].Genes Chromosomes Cancer，1999，24(3):283-285.

9.Jiang W，F(xiàn)reytag M，Schober Y，et al.Nilotinib is more potent than imatinib for treating plexiform neurofibroma in vitro and in vivo[J].PLoS One，2014，9(10):e107760.

（2015-05-08收稿）

中國科學院生物物理研究所博士生導師團隊加盟四川醫(yī)科大學的科學研究

為充分發(fā)揮中科院生物物理研究所與四川醫(yī)科大學的科技、人才優(yōu)勢，本著加強合作，共同培養(yǎng)研究型人才為目標，經(jīng)雙方友好協(xié)商，赫榮喬、袁增強、閻錫蘊、秦志海、孫堅原、劉平生等6位中國科學院生物物理研究所研究員、博士生導師正式受聘為四川醫(yī)科大學兼職教授及碩士生導師。

中國科學院生物物理研究所的6位博士生導師在腫瘤、神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等的基礎研究領域開展聯(lián)合科學研究、建立聯(lián)合實驗室、共同培養(yǎng)研究生、優(yōu)秀本科生等，與我校相關專業(yè)研究生導師合作開展科學研究、學科建設和人才培養(yǎng)等相關工作。

Evaluation of chemotherapeutic drug selectivity by using tumor primary culture immunofluorescence staining

Jiang Wei，Huang Wenfang，Lan kiuwe1，Victor-F.Mautner1，Reinhard E.Friedrich2
Department of Laboratory Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People's Hospital；1Department of Neuology，University Medical Center Hamburg-Eppendorf；2Oral and Maxillofacial surgery，University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Objective：To establish a new method for evaluating the selectivity and specificity of chemotherapeutic drug based on tumor primary culture immunofluorescence staining.Methods:Plexiform neurofibroma tissues cut from patients were used to culture primary tumor cells and non-tumor cells.These cells were treated by nilotinib and imatinib at different concentrations and stained by specific fluorescent antibodies. Proliferation and drug cytotoxicity were detected.The efficacy of drugs was evaluated after counting the proportion of stained tumor cells and non-tumor cells using ImageJ software.Results：After the drug treatment，the reduction in proliferation and increase in cytotoxic effect were directly propeotional to the concentration of the two anticancer drugs.The fluorescent cell count showed that the numbers of both Schwann cells and fibroblasts were reduced after drug treatment，but the effect of drugs was individuaized.Conclusion：These results suggest that after drug treatment measuring the change of proportion of tumor cells and non-tumor cells in a mixed culture enables the assessment of the selectivity and specificity of chemotherapeutic drugs.

Primary culture;Immunofluorescence staining;Chemotherapeutic drug;Individualized therapy

R331；R73-35+1；R739.43

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.019

姜偉（1981-），男，主管技師，博士，E-mail：jiangweiw.syy@outlook.com