個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的最新進(jìn)展

鐘焱 郭赟婧 夏小艷

(長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410100)

個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的最新進(jìn)展

鐘焱 郭赟婧 夏小艷

(長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410100)

用藥安全已成為國(guó)計(jì)民生最為關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。藥物的不良反應(yīng)不僅與藥物的用量、患者的性別、年齡、體重及生理病理進(jìn)程相關(guān),也與患者的遺傳因素密切關(guān)聯(lián)?；驒z測(cè)能夠有效反應(yīng)個(gè)體的遺傳因素,結(jié)合患者的實(shí)際情況,可對(duì)患者基因進(jìn)行個(gè)體化診斷和治療。本文就個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的現(xiàn)狀及發(fā)展進(jìn)行闡述。

個(gè)體化用藥 基因檢測(cè) PCR

個(gè)體化用藥就是藥物治療的“因人而已”、“私人定制”，充分考慮導(dǎo)致藥物差異反映的遺傳因素，對(duì)不同個(gè)體的藥物相關(guān)基因從分子水平進(jìn)行檢測(cè)，臨床醫(yī)生再結(jié)合病人的病情及實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，“量體裁衣”的選擇個(gè)體適應(yīng)的藥物種類及劑量，提高藥物療效，提高藥物療效，降低毒副作用，減輕病人痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，為國(guó)家節(jié)約大量藥物資源。

1 基因檢測(cè)助力個(gè)體化用藥

全球三分之一的死亡病例的致死原因不是疾病本身，而是不合理用藥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每天開(kāi)出300萬(wàn)份無(wú)效或錯(cuò)誤處方，中國(guó)每年因家庭用藥不良反應(yīng)導(dǎo)致住院的人數(shù)約為250萬(wàn)，而住院人數(shù)藥物不良反應(yīng)發(fā)生率達(dá)10-20%，藥物不良反應(yīng)死亡率為19種主要傳染病所致死亡人數(shù)的11倍，因藥物不良反應(yīng)增加的醫(yī)療費(fèi)用超過(guò)1000億美元。個(gè)體差異的不同會(huì)導(dǎo)致個(gè)體對(duì)同一藥物產(chǎn)生不同的不良反應(yīng)，個(gè)體差異是以遺傳背景和環(huán)境因素為背景，其中遺傳因素是決定性因素。人類90%的變異是由SNP(單核苷酸多態(tài)性)引起，進(jìn)而導(dǎo)致人類藥物代謝及反應(yīng)差異。個(gè)體化用藥基因檢測(cè)可對(duì)患者基因進(jìn)行個(gè)體化診斷，并在檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行個(gè)體化治療。

1.1 基因?qū)蛐缘膫€(gè)體化治療的優(yōu)勢(shì)

臨床藥物的適應(yīng)癥和使用劑量是根據(jù)臨床試驗(yàn)中多數(shù)人的結(jié)果或平均值而設(shè)定，醫(yī)生開(kāi)藥方時(shí)并無(wú)法知道藥物使用者是否處于藥物的有效范圍之內(nèi)。臨床傳統(tǒng)的用藥模式為疾病診斷、確定用藥方案、治療、監(jiān)控臨床反應(yīng)、調(diào)整治療方案，而基因?qū)虻膫€(gè)體化治療方式為疾診斷、遺傳分析、確定用藥方案、治療。這種“私人定制”的用藥模式不僅僅依靠病人病情和醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)選擇藥物，還將影響臨床藥物療效的決定性因素——遺傳因素考慮其中，保證藥物的安全有效。據(jù)統(tǒng)計(jì)，憑臨床經(jīng)驗(yàn)治療腫瘤的療效不到30%，如治療非小細(xì)胞肺癌的藥物——吉非替尼(Gefitinib，又名易瑞沙)，它的治療效果及不良反應(yīng)與患者癌細(xì)胞的EGFR基因是否發(fā)生突變緊密關(guān)聯(lián)，如肺癌患者不檢測(cè)EGFR基因突變而盲目給藥治療，患者存活期有可能會(huì)低于不治療者[1-2]。

從藥物進(jìn)入人體及其整個(gè)代謝過(guò)程，很多基因的多態(tài)性都會(huì)影響藥物的代謝，如CYP2C19基因的突變就大大影響抗酸藥奧美拉唑的代謝，代謝快的患者往往藥量不夠用，而代謝慢者則相對(duì)過(guò)量產(chǎn)生毒性。另外有些藥物代謝過(guò)程的差異更涉及一些"前藥"，如抗凝藥——波利維(硫酸氫氯吡格雷片)，它本身是一個(gè)前藥，其代謝過(guò)程通過(guò)激活CYP2C19基因來(lái)發(fā)揮藥效。而這個(gè)基因突變則代謝不能被激活進(jìn)而導(dǎo)致更高風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后不良，基因檢測(cè)可以協(xié)助臨床藥學(xué)工作者優(yōu)化藥物劑量。

1.2 個(gè)體化用藥基因檢測(cè)正在拉開(kāi)全球戰(zhàn)略序幕

美國(guó)FDA已批準(zhǔn)ROCHE、Third Wave、Nanosphere等多家公司一系列個(gè)體化用藥基因檢測(cè)產(chǎn)品，如：尋找吉非替尼適用人群的EFGR檢測(cè)試劑，檢測(cè)伊立替康適用人群的UGT1A1檢測(cè)試劑，指導(dǎo)長(zhǎng)效抗凝血藥物華法林使用劑量的CYP2C9及VKROC1檢測(cè)試劑等，這些產(chǎn)品已廣泛用于臨床實(shí)踐，取得良好效果，為國(guó)家節(jié)約大量用藥資源。迄今已有100余種藥物經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)貼上了遺傳標(biāo)簽，用于提示不同基因型的患者在應(yīng)用該藥物時(shí)可能產(chǎn)生的療效和毒性。藥物基因組學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床研究結(jié)果已經(jīng)在某些領(lǐng)域開(kāi)始轉(zhuǎn)化進(jìn)入藥物實(shí)施個(gè)體化治療，尤其是多種抗腫瘤藥物應(yīng)用前已在病人中開(kāi)展遺傳檢測(cè)以獲得預(yù)期的療效和避免嚴(yán)重毒性反應(yīng)[3-4]。

2 個(gè)體化用藥基因檢測(cè)方法及進(jìn)展

個(gè)體化用藥基因檢測(cè)技術(shù)形式多樣，大多為檢測(cè)患者的各類藥物相關(guān)基因的突變，如：傳統(tǒng)的PCR-直接測(cè)序技術(shù)、PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)及熒光定量PCR技術(shù)，以及新興的ARMS-PCR技術(shù)、HRM(high-resolution melting analysis)技術(shù)等。

2.1 PCR-直接測(cè)序技術(shù)

PCR-直接測(cè)序技術(shù)是將目的基因先進(jìn)行PCR擴(kuò)張，獲得一定量的產(chǎn)物后再進(jìn)行測(cè)序的方法，是一種經(jīng)典DNA的分析技術(shù)，在全國(guó)各大科研院校及醫(yī)院的臨床實(shí)踐應(yīng)用非常廣泛。Xin Cai等采用DNA測(cè)序法檢測(cè)EGFR、KRAS和TP53基因的突變來(lái)分析這些基因突變對(duì)肺癌病人用藥的影響[5]。這種傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)，耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度和精度較低，結(jié)果讀取繁瑣，但其檢測(cè)成本低、高通量，能檢測(cè)已知和未知較長(zhǎng)的序列。

2.2 PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)

PCR-焦磷酸測(cè)序也是一種先必須將目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序的方法。焦磷酸測(cè)序(pryosequencing，簡(jiǎn)稱PYRO)是一種全新的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)DNA測(cè)序技術(shù)，其原理為：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。與傳統(tǒng)的測(cè)序法相比，PYRO靈敏度和精度均較高，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)，不僅能檢測(cè)并區(qū)分所有已知序列，也能發(fā)現(xiàn)新的突變，但存在僅能準(zhǔn)確地測(cè)定較短的序列。

該不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，因其特定的優(yōu)勢(shì)，PYRO已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段，隨著技術(shù)的不斷成熟和改進(jìn)，在實(shí)踐中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。如Dinu D等用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)KRAS基因的多態(tài)性來(lái)分析其在結(jié)腸癌治療中的影響[6]。

2.3 ARMS-PCR技術(shù)

擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system)，簡(jiǎn)稱ARMS-PCR或等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等。其原理為：PCR擴(kuò)增引物的延伸是從其3`未端開(kāi)始的，而這種延伸要求引物3`端的堿基與模板序列需完全匹配，擴(kuò)增才得以延續(xù)并得到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物，若引物3`端與模板不能配對(duì)，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對(duì)應(yīng)的 擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)的不同，每個(gè)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常序列互補(bǔ)并擴(kuò)增得到正常序列的PCR產(chǎn)物，一個(gè)與突變序列互補(bǔ)而得到突變PCR產(chǎn)物，再根據(jù)溶解曲線的不同，就可以檢測(cè)并區(qū)分檢測(cè)位點(diǎn)的突變類型。該技術(shù)準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)便，且靈敏度高，能同時(shí)檢測(cè)

············兩種及兩種以上的基因的突變位點(diǎn)，但僅能檢測(cè)常見(jiàn)的已知位點(diǎn)，并存在假陽(yáng)性問(wèn)題，容易造成污染。

2.4 HRM技術(shù)

高分辨熔解曲線分析(high-resolution？melting？analysis，HRM)是興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法，其主要原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)短、GC含量及堿基互補(bǔ)的差異性，采用高分辨率的溶解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，因其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以區(qū)分單個(gè)堿基差異。這種技術(shù)具有成本低、高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，它在檢測(cè)SNP位點(diǎn)時(shí)，無(wú)需特異性的探針和熒光標(biāo)記，不受突變位點(diǎn)及類型的限制，已被廣泛用于個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的科研及臨床實(shí)踐中。

3 展望

目前由于藥物基因組學(xué)知識(shí)的局限性，尚不能對(duì)每種藥物進(jìn)行檢測(cè)，只能集中在迫切需要的領(lǐng)域。如腫瘤治療藥物的基因檢測(cè)是國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用最多的，一方面是因?yàn)槟[瘤治療觀察療效需要的時(shí)間長(zhǎng)，依據(jù)療效調(diào)整用藥往往會(huì)貽誤治療時(shí)機(jī)；另一方面是腫瘤治療藥物有效劑量到中毒劑量間的差距小，醫(yī)學(xué)上稱之為“窗口窄”，易發(fā)生毒副作用。與常規(guī)臨床檢測(cè)不同的是，由于藥物基因組學(xué)知識(shí)尚不普及，基因檢測(cè)技術(shù)尚有一定難度，目前僅有少數(shù)醫(yī)院或?qū)I(yè)化醫(yī)療機(jī)構(gòu)有能力開(kāi)展。另基因檢測(cè)質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)化方面還待進(jìn)一步完善。

[1]Sreenath V.Sharma, Daphne W.Bell, Jeffrey Settleman,etc., Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.Nature,2007,7:169-181.

[2]Yu Daping, Li Jie, Han Yi, Liu Shuku, etc., Gene expression profiles of ERCC1, TYMS, RRM1, TUBB3 and EGFR in tumor tissue from non-small cell lung cancer patients.Chinese Medical Journal,2014,127(8):1464-8.

[3]Rachel Abbots, Rosalyn Jewell, Jeremie Nsengimana, etc., Targeting human.apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) in phosphatase and tensin homolog (PTEN) deficient melanoma cells for personlized therapy.British Journal of Cancer, 2010, 102 (4)”704-9.

[4]Lei Xie, Xiaoxia Ge, Hepan Tan, etc., Towards structural systems pharmacology to study complex diseases and personalized medicine.PLoS Comput Biol, 2014,1-(5):e1033554.

[5]Xin Cai, Jiang Sheng, Chuanning Tang,etc., Frequent mutaitons in EGFR, KRAS AND TP53 gens in human lung cancer tumors detected by ion torrent DNA sequencing.Plos One, 2014,9(4): e95228.

[6]Dinu D, Dobre M, Panaitescu, etc., Prognostic significance of KRAS gene mutations in colorectal cancer- preliminary study [j].Journal of medicine and life,2014,7(4):581-7.