木荷組織培養(yǎng)技術(shù)研究

陳碧華 張娟 江斌 鄧永生 肖玉梅 張

摘要：對(duì)木荷外植體取材母株提前1周噴殺蟲(chóng)劑和殺菌劑，外植體污染率明顯降低。加入Vc可以減少外植體褐化，并采用全暗培養(yǎng)。選擇MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5mg·L-1作為木荷最佳外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1為木荷最佳增殖培養(yǎng)基，1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1作為木荷最佳生根培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：木荷;組織培養(yǎng);外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基;增殖培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：Q813.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2015）01-0016-04

Tissue Culture Technique of Schima superba

Chen Bihua（1，2，3）Zhang Juan（1，2）Jiang Bin（3）Deng Yongsheng（3）Xiao Yumei（3）Zhang Cui（3）

（1.Fujian Academy of Forestry SciencesFuzhou350012; 2. Key Laboratory of Timber Forest Breeding

and Cultivation for Mountainous Areas in Southern China， China Forestry Bureau

Fuzhou350012; Qingliu County Forestry Bureau in Fujian ProvinceSanming365300）

Abstract： The contamination rate of the explants of Schima superba during the process of tissue culture was decreased evidently by pre-treating the stock plants using the pesticides and fungicides before one week in advance. The browning rate of the explants was decreased by adding the Vitamine C and being culured in dark. MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1 was adopted as the optimal explant induction medium， MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1 was adopted as the optimal proliferation medium， and 1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1 was adopted as the optimal rooting medium.

Key words：Schima superba;tissue culture; explant induction medium; proliferation medium; rooting medium

木荷Schima superba山茶科木荷屬常綠大喬木，為我國(guó)南方主要的速生珍貴用材樹(shù)種與生物防火當(dāng)家樹(shù)種，木材用于制作木質(zhì)家具、木質(zhì)工藝品、人造板以及木地板。木荷不僅純林生長(zhǎng)與生態(tài)穩(wěn)定性好，而且又是杉木、馬尾松等針葉樹(shù)種良好的混交樹(shù)種。福建省木荷每年用種量很大，年種植面積達(dá)3萬(wàn)hm2以上，年用苗量7 000萬(wàn)株以上，是福建省造林面積最大的鄉(xiāng)土樹(shù)種。長(zhǎng)期以來(lái)，木荷以實(shí)生苗造林，而且長(zhǎng)期從福建省外調(diào)運(yùn)種子，由于有性繁殖過(guò)程中后代容易性狀分離，以致母樹(shù)優(yōu)良性狀丟失，后代分化嚴(yán)重，個(gè)體差異大。組培技術(shù)可以彌補(bǔ)有性繁殖帶來(lái)的缺陷，尤其是經(jīng)過(guò)選育后的優(yōu)良單株，采用組培快繁技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)種苗，營(yíng)造高質(zhì)量用材林和高效防火林帶，可以帶來(lái)顯著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生態(tài)效益。

國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)廣東徐位力等一篇對(duì)防火樹(shù)種木荷組培的簡(jiǎn)要報(bào)道，未見(jiàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析[1]。未見(jiàn)國(guó)外有關(guān)木荷組培的報(bào)道。本研究采用初選的木荷優(yōu)良單株基部萌芽條作為外植體，不僅可以保持母本優(yōu)良性狀得到遺傳增益，而且將來(lái)可以為社會(huì)提供大量?jī)?yōu)良木荷苗木。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為經(jīng)過(guò)初選的優(yōu)樹(shù)基部萌芽條。取其頂芽或半木質(zhì)化枝條作為外植體。

1.2方法

1.2.1 外植體滅菌

木荷頂芽或枝條作為外植體，很難消毒，尤其是雨季。①對(duì)母株不進(jìn)行任何處理;②對(duì)外植體母株預(yù)先處理，用有效成分4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍和40%樂(lè)果乳油800倍混合液對(duì)母株噴霧，次日用70%甲基托布津可濕性粉劑800倍和80%代森錳鋅可濕性粉劑800倍混合液對(duì)母株噴霧，在噴藥后1周之內(nèi)見(jiàn)晴天采集外植體。觀察外植體污染率。

外植體用自來(lái)水沖洗表面5～10 min，再用洗滌粉溶液浸泡15～20 min之后用自來(lái)水沖洗干凈，然后0.1%新潔爾滅溶液浸泡15～20 min，自來(lái)水沖洗干凈。在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用70%～75%醫(yī)用酒精浸泡30 s， 0.1%HgCl2消毒12～15 min， 無(wú)菌水沖洗4～5次。切去頂芽基部或莖段上下兩端，保留長(zhǎng)度約為1 cm左右的帶腋芽莖段，接于各種外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上[2]。

1.2.2培養(yǎng)條件

外植體誘導(dǎo)前2周進(jìn)行全暗培養(yǎng)，以后光照強(qiáng)度500～1 000 lx;繼代培養(yǎng)光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx;生根培養(yǎng)光照強(qiáng)度從1 000～1 500 lx增加到煉苗光照3 000～6 000 lx。培養(yǎng)溫度為26±2 ℃， 光照時(shí)間12 h·d-1。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1外植體誘導(dǎo)

外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：①M(fèi)S+BA 3.0 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc （抗壞血酸） 5 mg·L-1;②1/2MS+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1;③MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+ Vc 5 mg·L-1;④MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+ Vc 5 mg·L-1[3-4]。以上均附加白糖30 g·L-1（“田趣”牌，下同）和卡拉膠（閩南瓊膠有限公司出品，下同）6.0 g·L-1，pH6.0。每處理接種50瓶（200 mL廣口瓶），每瓶1個(gè)芽或莖段，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)污染和誘導(dǎo)啟動(dòng)情況。

1.3.2繼代培養(yǎng)基

繼代培養(yǎng)基為：⑤MS+ BA1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5mg·L-1+ B2（核黃素）5mg·L-1; ⑥ MS+ BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1; ⑦M(jìn)S+ BA0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1。以上基本均附加白糖30 g·L-1和卡拉膠6.0 g·L-1，pH6.0。每處理接種30瓶（200 mL廣口瓶），每瓶3個(gè)莖芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和莖芽高度。

1.3.3生根培養(yǎng)基

生根基本培養(yǎng)基采用：⑧1/4MS;⑨1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1;⑩1/4MS+IBA 0.5 mg·L-1;最后一個(gè)1/4MS+ IBA 1.0 mg·L-1。以上基本均附加白糖20 g·L-1和卡拉膠7.0 g·L-1，pH6.0。每處理接種10瓶，每瓶3個(gè)莖芽，重復(fù)3次。

1.3.4煉苗

培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d后的生根苗，移入玻璃溫室煉苗約15 d。光照度2 000～6 000 lx。生根接種40 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)和高度莖芽。

1.3.5移栽

以紅心土做為栽培基質(zhì)，裝入黑色塑料營(yíng)養(yǎng)袋，移入簡(jiǎn)易溫室中，以0.1‰～0.5‰高錳酸鉀消毒土壤。將煉苗后的木荷瓶苗，用自來(lái)水洗凈植株根部的培養(yǎng)基，70%甲基托布津可濕性粉劑1 000倍液和80%代森錳鋅可濕性粉劑1 000倍液混合浸泡10 min消毒后，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，覆蓋薄膜保濕。每天向葉片噴水1次、澆透水，2周后揭開(kāi)薄膜，并且每天噴1～3次，以后逐漸過(guò)渡到每天噴1次。

采用SPSS11.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，置信度0.05或0.01。

2結(jié)果與分析

2.1外植體滅菌

木荷外植體很難消毒，在外植體母株未預(yù)先處理情況下，采用酒精、升汞或次氯酸鈉等消毒液進(jìn)行消毒處理，污染率達(dá)到83.3%～100%。加上外植體容易褐化，很難得到無(wú)污染而且無(wú)褐化的外植體。經(jīng)過(guò)觀察分析發(fā)現(xiàn)：主要污染原因在于春夏季福州經(jīng)常下雨，并且木荷苗木上面有很多蚜蟲(chóng)危害。蚜蟲(chóng)以刺吸式口器從苗中吸收汁液的同時(shí)，也把微生物帶進(jìn)植株體內(nèi)，致使外植體內(nèi)部攜帶細(xì)菌或真菌，外植體消毒時(shí)，消毒液難以進(jìn)入外植體內(nèi)殺滅細(xì)菌或真菌，導(dǎo)致外植體污染率很高。

采用對(duì)外植體母株預(yù)先處理，即方法（2），外植體污染率降為40.4%～80.0%，外植體無(wú)污染率明顯提高。

2.2外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

木荷外植體誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外植體褐化嚴(yán)重，因此加入Vc 5 mg·L-1以減少褐化，并采用全暗培養(yǎng)。采用置信度0.05和0.01，分析結(jié)果表明：1號(hào)培養(yǎng)基平均誘導(dǎo)率為39.2%，2號(hào)培養(yǎng)基為13.8%，兩者具有極顯著差異。這兩種培養(yǎng)基除了基本培養(yǎng)基不同，其余激素等添加物完全相同，所以選擇1號(hào)培養(yǎng)基的MS為基本培養(yǎng)基，淘汰2號(hào)培養(yǎng)基。表1結(jié)果同時(shí)表明：3號(hào)培養(yǎng)基平均誘導(dǎo)率為66.3%，4號(hào)培養(yǎng)基為68.5%，兩者沒(méi)有顯著差異，但3號(hào)培養(yǎng)基有愈傷組織產(chǎn)生，導(dǎo)致芽生長(zhǎng)緩慢并且伸長(zhǎng)困難;而4號(hào)培養(yǎng)基無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，幾乎全部芽抽高且生長(zhǎng)正常，因此選擇培養(yǎng)基④MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1 + Vc 5mg·L-1為木荷外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖1木荷增殖材料

圖2木荷生根瓶苗

2.3增殖培養(yǎng)基的選擇

在超凈工作臺(tái)上，對(duì)誘導(dǎo)成功的木荷外植體，切下新芽，剔除老枝，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。分析結(jié)果表明：5～7號(hào)培養(yǎng)基平均增殖率分別為4.3倍、3.2倍和0.7倍，三者之間具有顯著差異，對(duì)于平均莖芽高度，3種培養(yǎng)基分別為0.8 cm、2.3 cm和3.4 cm，三者之間同樣具有顯著差異。由于7號(hào)培養(yǎng)基平均增殖率太低，5號(hào)培養(yǎng)基平均莖芽高度太小，不符合組培工廠化育苗的要求，只有6號(hào)培養(yǎng)基MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1，在增殖率和莖芽高度方面同時(shí)符合組培工廠化育苗技術(shù)要求，所以選擇該培養(yǎng)基作為木荷增殖培養(yǎng)基。（圖1）

2.4生根培養(yǎng)基的選擇

將增殖培養(yǎng)獲得的木荷有效生根莖芽轉(zhuǎn)接到1/2MS為基本培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d，隨后煉苗15 ，統(tǒng)計(jì)其生根狀況，結(jié)果（表3）。結(jié)果表明：沒(méi)有添加IBA的8號(hào)培養(yǎng)基，沒(méi)有生根，不能作為生根培養(yǎng)基;9號(hào)和10號(hào)培養(yǎng)基的平均生根率、平均根條數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均苗高均較理想、而且植株生長(zhǎng)正常，但10號(hào)培養(yǎng)基的平均苗高為2.8 cm，9號(hào)培養(yǎng)基為3.9 cm;11號(hào)培養(yǎng)基的平均苗高太低，僅為1.8 m，且生根率較低，僅為57.1%。綜上所述，選擇9號(hào)培養(yǎng)基 1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1作為木荷生根培養(yǎng)基（圖2）。

2.5組培苗木移栽

木荷組培瓶苗經(jīng)過(guò)15 d煉苗后，洗凈培養(yǎng)基后移栽到簡(jiǎn)易溫室，移栽基質(zhì)為紅心土，基質(zhì)經(jīng)0.3‰～0.5‰高錳酸鉀消毒，移栽后經(jīng)過(guò)覆蓋薄膜保濕和注意防治病蟲(chóng)害，30 d后觀察成活率達(dá)到90%以上。經(jīng)過(guò)表型觀察，苗木未見(jiàn)發(fā)生變異。

3結(jié)論和討論

（1）確定最佳木荷外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 + Vc 5 mg·L-1;增殖培養(yǎng)基為：MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1;生根培養(yǎng)基為：1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1。

（2）木荷外植體很難消毒，必須對(duì)母株進(jìn)行預(yù)處理，用有效成分4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍和40%樂(lè)果乳油800倍混合液對(duì)母株噴霧，次日用70%甲基托布津可濕性粉劑800倍和80%代森錳鋅可濕性粉劑800倍混合液對(duì)母株噴霧，在噴藥后一周之內(nèi)見(jiàn)晴天采集外植體。外植體污染率降為40.4%～80.0%，外植體無(wú)污染率明顯提高。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外植體褐化嚴(yán)重，因此加入Vc 5 mg·L-1以減少褐化，并采用全暗培養(yǎng)。

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（責(zé)任編輯：鄭京津）

基金項(xiàng)目：福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（閩林研〔2012〕25號(hào)）;福建省林業(yè)廳科研項(xiàng)目“木荷優(yōu)良單株選擇與組培技術(shù)研究”（閩林科〔2012〕 3號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：陳碧華（1967～），男，福建龍海人，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事林業(yè)生物技術(shù)研究工作。