補(bǔ)腎活血方對(duì)卵巢早衰小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響

劉慧萍等

摘要：目的 探討補(bǔ)腎活血方抑制卵巢早衰（POF）小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 以小鼠透明帶3為抗原，皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c雌性小鼠建立免疫性POF模型。取40只清潔級(jí)雌性小鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、補(bǔ)腎活血方組。補(bǔ)腎活血方組給予補(bǔ)腎活血方藥液灌胃，陽(yáng)性藥組給予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)15 d。取卵巢、子宮、胸腺進(jìn)行稱重，計(jì)算其臟器指數(shù)；HE染色觀察顆粒細(xì)胞凋亡情況；采用放射免疫法檢測(cè)雌二醇（E2）、促黃體生成激素（LH）和促卵泡生成激素（FSH）的水平；采用RT-PCR分析卵巢顆粒細(xì)胞中Fas、Fas-L mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 與空白組比較，模型組卵巢、胸腺、子宮質(zhì)量和E2水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），F(xiàn)SH、LH水平和Fas、Fas-L mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，給藥組顆粒細(xì)胞凋亡明顯減少，卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、胸腺指數(shù)增加（P<0.05），E2水平升高（P<0.01），F(xiàn)SH、LH水平及Fas、Fas-L mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的激素水平，通過(guò)降低Fas、Fas-L的mRNA表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎活血方；卵巢早衰；顆粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0047-04

Effects of Bushen Huoxue Prescription on Granulosa Cell Apoptosisi of Premature Ovarian Failure Mice LIU Hui-ping， XIAO Yi， LI Ling， QI Peng， SONG Yan， LI Jia-jun， YI Hai-qing， KE Chao， ZHANG Guo-min （Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract：Objective To discuss Bushen Huoxue Prescription mechanism of action on follicular granulosa cell apoptosis of premature ovarian failure （POF） mice. Methods The mouse zona pellucida 3 as the antigen， multi-point injection of subcutaneous immunization BALB/c to female mice was used to establish autoimmune POF model. Forty clean female mice were randomly divided into blank group， model group， Estradiol Valerate group and Bushen Huoxue Prescription group. All medicine groups were given relevant medicine for gavage， while model and blank groups were given normal saline with the same amount for gavage for 15 days. After the treatment， ovary， uterus， and thymus were weighed， and the viscera index was calculated. An ovarian slice was taken and HE staining was used to observe granulosa cell apoptosis. The levels of E2， LH， and FSH were detected by using the radioimmunoassay method. RT-PCR was used to analyze Fas and Fas-L mRNA expressions in ovarian granulosa cells. Results Compared with blank group， the weight of ovary， thymus， and uterus decreased significantly （P<0.05， P<0.01）；Serum E2 level dropped （P<0.01）；levels of FSH and LH， and expressions of Fas and Fas-L mRNA increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， granulosa cell apoptosis significantly decreased， and ovary index， uterus index， and thymus index increased （P<0.05）；serum E2 level

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81303123）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2013T60770、2012M511382）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20114323120007）；湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2014XNFZ06）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心資助項(xiàng)目（2013年）；湖南省重點(diǎn)學(xué)科-中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)（2012年）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科-病理學(xué)及病理生理學(xué)（2012年）

通訊作者：張國(guó)民，E-mail：834095773@qq.com

increased （P<0.01）；levels of FSH and LH， and expressions of Fas and Fas-L mRNA significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue Prescription can decrease expressions of Fas and Fas-L mRNA to inhibit cell apoptosis by adjusting the hormone level of hypothalamus-pituitary- ovarianaxis.

Key words：Bushen Huoxue Prescription；premature ovarian failure；granulose cell；cell apoptosis；mice

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指婦女40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、雌激素缺乏、促性腺激素水平升高為特征的一種疾病。國(guó)外研究顯示，本病在40歲以前的婦女中發(fā)病率為1%～2%，30歲以前的婦女發(fā)病率為0.1%，20歲以前的發(fā)病率為0.01%[1-2]。該病可導(dǎo)致不孕、更年期癥狀提前、骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥，伴隨卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、胞漿出現(xiàn)空泡、形成閉鎖小體等凋亡形態(tài)的改變。卵泡顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞體內(nèi)外成熟過(guò)程中起著重要的作用。研究表明，由生殖激素控制的顆粒細(xì)胞凋亡是直接控制卵泡排卵或閉鎖的重要因素[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)腎活血方對(duì)POF小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制，為研究卵巢細(xì)胞凋亡及人為控制卵泡的發(fā)育等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

40只清潔級(jí)健康雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，7～8周齡，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水和攝食。

1.2 藥物

補(bǔ)腎活血方由紫石英、補(bǔ)骨脂、菟絲子、熟地黃、生地黃、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鱉蟲、水蛭、雞內(nèi)金、路路通、澤瀉、澤蘭、桔梗、烏藥、甘草組成。武火煮沸，文火煮40 min，過(guò)濾，重復(fù)煎2次，合并濾液，濃縮至2倍臨床等效劑量1.08 g/mL的無(wú)菌藥液。飲片購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。戊酸雌二醇片，德國(guó)拜耳醫(yī)藥有限公司，批號(hào)J20130009，用溫開水溶解藥片，制成溶液，調(diào)整濃度為0.006 mg/mL。購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠透明帶多肽溶液，小鼠透明帶3（ZP3）的第330-342個(gè)氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），分析純度>90%，杭州中肽生化有限公司，批號(hào)P00105；弗氏完全佐劑，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)F5881；弗氏不完全佐劑，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)F5506；雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）放免試劑盒，批號(hào)08112O，購(gòu)自北京科瑞美科技有限公司；總RNA提取試劑盒，批號(hào)092134，購(gòu)自北京佰億新創(chuàng)科技有限公司；總RNA提取試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技有限公司。MP-120-2型電子天平（上海第二天平儀器廠）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、LEICA RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司生產(chǎn)）。

1.4 造模與分組

取6 mg ZP3透明多肽粉末，加入6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1配制成免疫強(qiáng)化試劑。每日上午9點(diǎn)，參考文獻(xiàn)[4]方法，每只小鼠給予0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后以免疫強(qiáng)化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強(qiáng)免疫，建立免疫性POF模型?？瞻捉M每次造模時(shí)每只小鼠予0.15 mL生理鹽水注射雙后腳掌處及腹腔皮下。取40只清潔級(jí)雌性小鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、補(bǔ)腎活血方組，每組10只。補(bǔ)腎活血方組以2倍臨床等效劑量（1.08 mL/20 g）補(bǔ)腎活血方藥液灌胃，陽(yáng)性藥組給予0.4 mL/20 g戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，均2次/d，連續(xù)15 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 臟器指數(shù)檢測(cè) 眼球取血后，脫頸處死動(dòng)物，摘取卵巢、子宮、胸腺組織稱重，計(jì)算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.5.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 取卵巢稱重后，加入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規(guī)HE染色，做病理切片。觀察卵巢內(nèi)正常卵泡和閉鎖卵泡的形態(tài)變化。

1.5.3 雌二醇、促黃體生成激素和促卵泡生成激素檢測(cè) 眼球取血，并迅速離心分離出血清，采用放射免疫法檢測(cè)血清中E2、FSH、LH的含量。

1.5.4 Fas、Fas-L基因表達(dá)檢測(cè) 取卵巢組織勻漿，用RNA試劑盒提取mRNA，采用RT-PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞中Fas、Fas-L mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，成組設(shè)計(jì)資料采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組卵巢、胸腺、子宮指數(shù)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、補(bǔ)腎活血方組卵巢、胸腺、子宮指數(shù)升高（P<0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，補(bǔ)腎活血方組小鼠卵巢、胸腺指數(shù)升高（P<0.05），子宮指數(shù)無(wú)明顯變化。見(jiàn)表1。

2.2 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠雌二醇、促黃體生成素和促卵泡生成素水平的影響

與空白組比較，模型組E2水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方組、陽(yáng)性藥組E2水平升高，F(xiàn)SH、LH水平均降低（P<0.01）；與陽(yáng)性藥組比較，補(bǔ)腎活血方組E2水平升高，F(xiàn)SH、LH水平降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠卵巢形態(tài)學(xué)及顆粒細(xì)胞凋亡的影響

鏡下觀察模型組卵巢體積縮小，卵巢皮質(zhì)內(nèi)見(jiàn)少量初級(jí)卵泡及生長(zhǎng)卵泡，黃體數(shù)量少，閉鎖卵泡多，可見(jiàn)較多間質(zhì)、纖維血管、間質(zhì)腺，顆粒細(xì)胞凋亡明顯，數(shù)量明顯減少；補(bǔ)腎活血方組卵巢皮質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量初級(jí)卵泡及生長(zhǎng)卵泡，較多近成熟卵泡，黃體數(shù)多，黃體生長(zhǎng)良好，顆粒細(xì)胞凋亡明顯少于模型組。見(jiàn)圖1。

2.4 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠卵巢中Fas、Fas-L mRNA表達(dá)的影響

Fas、Fas-L mRNA灰度分析結(jié)果見(jiàn)圖2。與空白組比較，模型組Fas、Fas-L mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方組Fas、Fas-L mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）。

3 討論

卵巢早衰在中醫(yī)學(xué)中無(wú)專門記載，可歸屬于“血枯”“血隔”“閉經(jīng)”等范疇。其病因病機(jī)主要為腎虛胞阻，治療原則主要是補(bǔ)腎通絡(luò)。補(bǔ)腎活血方由湖南中醫(yī)藥大學(xué)尤昭玲教授經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐組方，主治腎虛胞阻型卵巢早衰[5-6]。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，用藥精當(dāng)，既符合中醫(yī)組方特色，又依據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法，切中病機(jī)，以達(dá)補(bǔ)腎通絡(luò)之功效。本病是腎陰、腎陽(yáng)同時(shí)虛損所致，故方中重用紫石英溫補(bǔ)腎陽(yáng)，熟地黃平補(bǔ)腎陰，兩藥共為君藥；補(bǔ)骨脂、菟絲子、生地黃、桑寄生、山萸肉、覆盆子合用為臣藥，使腎陰得養(yǎng)、腎陽(yáng)得化；澤瀉、澤蘭、生雞內(nèi)金、路路通、土鱉蟲、水蛭走沖任而活血利水通胞絡(luò)，祛瘀通滯；桔梗、烏藥條暢氣機(jī)，使氣血沖任通暢，月經(jīng)順時(shí)而下，利于卵子排出，二者合用為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使?，F(xiàn)代藥理研究表明，紫石英、補(bǔ)骨脂等補(bǔ)腎藥有類激素樣作用，能改善POF引起的雌激素分泌不足，提高子宮內(nèi)膜的容受性，改善宮頸黏液的分泌，利于精子通過(guò)[7]。補(bǔ)腎陽(yáng)藥可增強(qiáng)黃體功能，利于早期妊娠。活血化瘀藥可使血管擴(kuò)張，改善器官的血流量和高凝狀態(tài)，穩(wěn)定子宮和輸卵管的內(nèi)環(huán)境。因此，補(bǔ)腎藥與活血化瘀通絡(luò)藥配伍有利于調(diào)經(jīng)和助孕，是將中西病理、病機(jī)、藥理融會(huì)貫通，也正是該方的靈魂所在。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活方可使卵巢和胸腺質(zhì)量增加，卵巢指數(shù)上升，發(fā)育成熟卵泡較多，卵泡顆粒細(xì)胞層增多，卵巢間質(zhì)淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)減少。而顆粒細(xì)胞是卵巢周期激素合成的主要部位，表明補(bǔ)腎活血方的療效機(jī)制是促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成，分泌E2并釋放入血，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)卵泡、子宮發(fā)育，使子宮、卵巢質(zhì)量增加。胸腺是機(jī)體的免疫器官，經(jīng)治療后，各組胸腺指數(shù)均上調(diào)，胸腺細(xì)胞數(shù)量增加，使胸腺細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，對(duì)自身抗體應(yīng)答的細(xì)胞被消除或抑制，從而形成對(duì)自身抗原的耐受性。由此可見(jiàn)，補(bǔ)腎活血方能調(diào)節(jié)和改善機(jī)體的免疫功能，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生受多種基因表達(dá)的調(diào)控，以Fas/Fas-L系統(tǒng)為代表的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是其中的重要途徑[8-9]。Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體，與其配體Fas-L結(jié)合后活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，從而誘導(dǎo)表達(dá)Fas的靶細(xì)胞凋亡[10]。研究結(jié)果顯示，模型組Fas mRNA表達(dá)明顯高于正常組；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方組Fas mRNA表達(dá)水平降低。表明Fas/Fas-L通路的激活可能是顆粒細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究表明，補(bǔ)腎活血方對(duì)藥物造成的卵巢早衰具有一定療效，通過(guò)提高E2，降低LH、FSH的激素水平和抑制Fas、Fas-L基因的表達(dá)，從而改善卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2014-11-09）

（修回日期：2014-11-25；編輯：華強(qiáng)）