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    高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)蟲(chóng)草制品中腺苷和蟲(chóng)草素含量的研究

    2015-05-30 10:48:04黃麗俊李利東宓曉黎
    農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜腺苷

    黃麗俊 李利東 宓曉黎

    摘要:對(duì)已有方法和規(guī)范中樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化和對(duì)比研究,建立檢測(cè)蟲(chóng)草制品中腺苷和蟲(chóng)草素含量的反相高效液相色譜方法。樣品經(jīng)水超聲提取40min,離心過(guò)濾后進(jìn)行分析。采用C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),以水-甲醇(85:15,V/V)為流動(dòng)相,流速為1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。本方法檢測(cè)限為0.2μg/mL,定量限為1.0μg/mL。以所建立的方法對(duì)蟲(chóng)草制品進(jìn)行分析,樣品加標(biāo)回收率在94%~103%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,并能同時(shí)測(cè)定腺苷和蟲(chóng)草素。

    關(guān)鍵詞:蟲(chóng)草制品;高效液相色譜;腺苷;蟲(chóng)草素

    中圖分類號(hào):O657.7+2

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    論文編號(hào):2014-0289

    0引言

    蛹蟲(chóng)草為子囊菌亞門(mén)麥角菌目麥角菌科蟲(chóng)草屬的模式種,又名北冬蟲(chóng)夏草,可人工批量培育,與冬蟲(chóng)夏草是同屬,2009年被批準(zhǔn)為新資源食品。由于蟲(chóng)草具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用而引發(fā)人們的關(guān)注,并深度開(kāi)發(fā),目前市場(chǎng)上有以蟲(chóng)草為原料的各類藥品、保健食品及食品,其劑型有含片、膠囊、口服液、固體飲料、酒等。中國(guó)藥典2010版冬蟲(chóng)夏草項(xiàng)下腺苷含量測(cè)定采用HPLC法,CFDA用HPLC測(cè)定蛹蟲(chóng)草菌粉中蟲(chóng)草素含量,《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版(簡(jiǎn)稱《規(guī)范》)中的要求以蟲(chóng)草為主要原料的保健食品中腺苷的測(cè)定用HPLC方法,用藥典或《規(guī)范》中的方法測(cè)定蟲(chóng)草類制品中腺苷含量時(shí)結(jié)果偏低,上述方法均單一檢測(cè)蟲(chóng)草中腺苷或蟲(chóng)草素。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116-2012可同時(shí)檢測(cè)蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素,但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)采用高效液相色譜法測(cè)定蛹蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素含量的報(bào)道較多,腺苷和蟲(chóng)草素等核苷類成分是蟲(chóng)草的主要功效成分,因此對(duì)這2種成分的檢測(cè)尤為重要。本研究目的是盡量簡(jiǎn)化樣品前處理步驟,避免使用有毒有機(jī)溶劑,優(yōu)化HPLC方法,建立同時(shí)測(cè)定蟲(chóng)草制品中腺苷和蟲(chóng)草素的HPLC方法。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

    研究室內(nèi)試驗(yàn)在江蘇無(wú)錫進(jìn)行。

    1.2儀器與試劑

    戴安UltiMate3000高效液相色譜儀,UltiMate3000紫外檢測(cè)器,Chromeleon色譜工作站;KQ-100B超聲波清洗器,腺苷、蟲(chóng)草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所),甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑為分析純,試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

    1.3試驗(yàn)方法

    1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取腺苷對(duì)照品0.0190g,用流動(dòng)相溶解并定容至25mL容量瓶,稱取蟲(chóng)草素對(duì)照品0.0160g用流動(dòng)相溶解并定容至50mL容量瓶,分別配制成含腺苷0.76mg/mL和蟲(chóng)草素0.32mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    (1)混合標(biāo)準(zhǔn)液:分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于10mL容量瓶中,水定容至刻度,配制成含腺苷76μg/mL和蟲(chóng)草素32μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

    (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度:將混合標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋分別配制成腺苷濃度為2.375、4.75、9.5、19、38μg/mL,蟲(chóng)草素濃度為1、2、4、8、16μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.3.2樣品的前處理 將蛹蟲(chóng)草制品混和均勻,精確稱取樣品1.0g于50mL離心管中,加入25mL提取液后超聲提取,提取結(jié)束后用提取液定容至刻度,混勻后以10000vpm離心10min,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜分析用。

    1.3.3色譜條件 色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm,5μm)流動(dòng)相:水-甲醇(85:15,V/V);流速1.0mL/min;進(jìn)樣量為20μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。

    2結(jié)果與分析

    2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

    2.1.1提取溶劑的選擇 中國(guó)藥典中用90%甲醇加熱回流提取,《規(guī)范》中用60%乙醇提取,農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中用水提取,筆者分別比較了同等處理?xiàng)l件下,水、60%乙醇、90%甲醇、100%乙醇5種溶劑提取效果,結(jié)果顯示以水提取效果最好,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

    由表1可知,所測(cè)樣品中腺苷和蟲(chóng)草素含量均隨提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低,用水提取的含量最高,這與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)使用的提取溶劑一致。

    2.1.2提取時(shí)間的選擇 同一個(gè)樣品,用水作為提取劑,分別超聲提取10、40、80、180min,結(jié)果見(jiàn)表2。

    由表2可知,在水做提取溶劑的條件下,提取時(shí)間短則提取不完全,超聲40min時(shí)蟲(chóng)草素含量達(dá)到最大,隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)提取效果沒(méi)有增加,所以提取時(shí)間定為40min。

    2.2液相色譜條件的選擇

    2.2.1流動(dòng)相的選擇 中國(guó)藥典和《規(guī)范》中選用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動(dòng)相,而長(zhǎng)期使用鹽相會(huì)減少色譜柱的使用壽命,從而增加檢測(cè)成本。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中選用乙腈-水(5:95,V/V)作為流動(dòng)相,考慮到乙腈的毒性較大,筆者采用不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相,對(duì)腺苷和蟲(chóng)草素的分離效果進(jìn)行比較,最終確定甲醇-水(15:85,V/V)為流動(dòng)相,流速1.0mL/min,在此條件下,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中腺苷和蟲(chóng)草素能得到很好分離,色譜圖見(jiàn)圖1,樣品圖譜中腺苷和蟲(chóng)草素的保留時(shí)間與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致,并且與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

    2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取腺苷和蟲(chóng)草素對(duì)照品溶液在200-400mm進(jìn)行紫外掃描,發(fā)現(xiàn)腺苷和蟲(chóng)草素的最大吸收波長(zhǎng)為260nm,因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

    2.3方法學(xué)考察

    2.3.1方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限 將標(biāo)準(zhǔn)系列依次進(jìn)樣,進(jìn)樣量均為20μL,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行線性回歸,得腺苷標(biāo)準(zhǔn)系列(2.375~38μg/mL)的回歸方程為:Y=0.981X+0.2074,r=1;蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)系列(1.00~32.0μg/mL)的回歸方程為:Y=0.9795X+0.0806,r=1。腺苷和蟲(chóng)草素在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)定色譜峰達(dá)到3倍信噪比時(shí),對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為檢出限;達(dá)到10倍信噪比時(shí),對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為定量限。即本方法檢出限為0.2μg/mL,定量限1.0μg/mL。

    2.3.2重復(fù)性試驗(yàn) 取6份平行樣品,按照優(yōu)化后的條件進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果樣品中腺苷、蟲(chóng)草素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為227、74.5mg/100g,RSD分別為1.12%和1.35%(n=6),表明本方法的重復(fù)性良好。

    2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 樣品用水超聲提取40min后,分別放置0、4、8、12、24h后進(jìn)樣,測(cè)定腺苷、蟲(chóng)草素的峰面積,結(jié)果腺苷、蟲(chóng)草素的峰面積的RSD分別為2.12%和1.56%,表明試驗(yàn)提取的溶液,腺苷和蟲(chóng)草素的含量在24h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。

    2.3.4方法準(zhǔn)確度及精密度 取已知含量的3種蟲(chóng)草制品,按照1.3.2章節(jié)下提到的方法處理,在1.3.3條件下測(cè)定,同時(shí)進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)樣品每個(gè)添加水平取平行樣3份,計(jì)算方法回收率和精密度,結(jié)果見(jiàn)表3。加標(biāo)回收率在94%~103%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。說(shuō)明該方法加標(biāo)回收效果較好,適合于蟲(chóng)草制品含量測(cè)定。

    3討論

    農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2116-2012蟲(chóng)草制品中蟲(chóng)草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法可以很好地分離蟲(chóng)草素和腺苷,但是需要用水超聲提取3h,耗時(shí)較長(zhǎng),本試驗(yàn)對(duì)不同提取時(shí)間進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)提取40min后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)腺苷蟲(chóng)草素含量沒(méi)有提高。

    《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版和中國(guó)藥典2010版冬蟲(chóng)夏草項(xiàng)下腺苷含量測(cè)定,都采用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動(dòng)相,作者比較幾種流動(dòng)相分離效果,水-甲醇(85:15,V/V)作為流動(dòng)相時(shí)樣品中腺苷和蟲(chóng)草素的色譜峰分離度大于1.5,能夠得到很好地效果,同時(shí)此流動(dòng)相避免磷酸鹽對(duì)色譜柱的損傷。本研究建立的液相色譜方法操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高,適合于蟲(chóng)草制品中腺苷和蟲(chóng)草素定性定量分析。

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