雙黃連粉針劑UPLC—MS指紋圖譜的建立及聚類分析

顧媛媛等

摘要：目的 建立雙黃連粉針劑的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜。方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫40 ℃。對13批雙黃連粉針劑的特征色譜圖進行聚類分析，同時采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》對其質(zhì)量進行評價。結(jié)果 建立了13批雙黃連粉針劑的UPLC指紋圖譜共有模式，特征圖譜有16個共有峰，以對照品為對照，指認了3個主要色譜峰，各色譜峰有較好的分離效果。各批次間一致性良好，工藝穩(wěn)定。結(jié)論 本方法快速、高效，可用于全面控制雙黃連粉針劑的質(zhì)量。

關鍵詞：雙黃連粉針劑；指紋圖譜；超高效液相色譜法；聚類分析

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0091-04

雙黃連粉針劑由金銀花、黃芩、連翹3味中藥經(jīng)提取精制成中藥注射劑，臨床上加入適當溶媒供靜脈注射用，現(xiàn)已廣泛用于治療肺炎、扁桃體炎、上呼吸道感染、急性腎盂腎炎、急性膽囊炎、小兒腸炎、嬰幼兒肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒Ⅲ型感染等多種疾病[1]。

中藥指紋圖譜對中藥材和中藥制劑的質(zhì)量控制具有重要作用，也是中藥質(zhì)量標準一種重要的檢測手段。中藥指紋圖譜技術能標示出中藥材的特征圖譜和共有峰圖譜，從而辨別真?zhèn)危糜诳刂浦兴幉牡馁|(zhì)量，評價制劑原料藥材、半成品及成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。超高液相色譜法（UPLC）相對于高效液相色譜法具有更好的分離效率、峰容量及靈敏度[2]，現(xiàn)有的對于雙黃連粉針劑的質(zhì)量控制方法是以黃芩苷、綠原酸和連翹苷為質(zhì)量控制指標，而這種質(zhì)量評價方法不夠全面，因此，本試驗建立雙黃連粉針劑的UPLC指紋圖譜，為高效控制和評價雙黃連粉針劑的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀（包括在線真空脫氣機、自動進樣器、四元梯度泵、二極管陣列檢測器和柱溫箱），美國Micromass Q-TOF microTM四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（電噴霧離子源-正、負離子掃描方法-Lockspray），MassLynx V4.1色譜工作站，KQ-5200E昆山舒美超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），JA-2003精密電子天平（上海市良平儀器廠）。

對照品黃芩苷（批號110715-201314，供含量測定用）、連翹苷（批號110821-201213，供含量測定用）、綠原酸（批號110753-201314，供含量測定用），購于中國食品藥品檢定研究院；雙黃連粉針劑由哈藥集團中藥二廠生產(chǎn)，批號1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418、1409419。乙腈為色譜純（美國Fisher公司），甲酸為色譜級（天津科密歐化學試劑有限公司），其他試劑均為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水，梯度洗脫（0→3 min，5%→10%A；3→5 min，10%→12%A；5→9 min，12%→14%A；9→10 min， 14%→16%A；10→12 min，16%→19%A；12→14 min， 19%→20%A；14→16 min，20%→23%A；16→18 min， 23%→40%A；18→22 min，40%→100%A；22→23 min， 100%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI），采用正離子掃描檢測；碰撞能：100 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥器流速：11 L/min；霧化器壓力：276 kPa；毛細管電壓：4 kV；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～1500。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取黃芩苷、連翹苷、綠原酸對照品，加50%甲醇溶液分別制成每1 mL含黃芩苷0.1 mg、連翹苷60 μg、綠原酸40 μg的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

從每批次隨機取本品5支的內(nèi)容物，混勻，取本品50 mg，精密稱定，置25 mL錐形瓶中，加50%甲醇溶液20 mL，密塞后超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz） 20 min，定容于25 mL容量瓶中，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取雙黃連粉針劑樣品（批號1409405），按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，檢測其特征指紋圖譜，各共有色譜峰相對于參比峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%，表明所用儀器精密度良好[3]。

2.5.2 重復性試驗 取雙黃連粉針劑樣品（批號1409405），按“2.4”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。各共有色譜峰相對于參比峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%，結(jié)果表明本方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取雙黃連粉針劑供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，在0、2、4、6、8、12、24 h檢測特征指紋圖譜，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各共有色譜峰相對于參比峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%，表明本品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品測定

取13個批次雙黃連粉針劑，分別按“2.4”項下方法依次制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，依次進樣3 μL檢測，記錄色譜圖。13批樣品疊加圖見圖1，對照品和供試品色譜圖見圖2。

2.7 指紋圖譜分析與評價

2.7.1 共有峰的確定 通過對13批樣品的指紋圖譜進行分析，選擇特征明顯的16個色譜峰為共有峰。根據(jù)13批供試品溶液UPLC指紋圖譜給出的參數(shù)，比較供試品圖譜，有16個色譜峰是各批供試品所共有的，分別為1、2、4、6、7、8、9、13、14、15、19、21、22、24、27、28號色譜峰，并指認了其中3個色譜峰為特征峰，并對其進行定性，分別為綠原酸（4號峰）、黃芩苷（22號峰）、連翹苷（24號峰）。

2.7.2 參比峰的選擇 在各批次雙黃連粉針劑的色譜圖中，綠原酸的色譜峰（4號峰）峰面積適中，分離度良好，且為所有批次樣品所共有，故確定綠原酸的色譜峰為參照峰。

2.7.3 相似度評價 將13批雙黃連粉針劑的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》軟件，評價其相似度[4]，結(jié)果依次為0.911、0.944、0.965、0.934、0.946、0.955、0.978、0.946、0.975、0.971、0.965、0.939、0.906。13個批次雙黃連粉針劑的相似度除1409405、1409419兩批次略低，其余批次均較高，說明其工藝比較穩(wěn)定。用該方法可對雙黃連粉針劑進行質(zhì)量控制。

2.7.4 聚類分析 將13批雙黃連粉針劑進行UPLC指紋圖譜分析所獲得的16個共有峰，相對參比峰進行色譜峰面積標準化，共得到16×13階原始數(shù)據(jù)矩陣，采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)結(jié)的方法，度量標準采用歐式距離[5]，聚類分析樹狀圖見圖3。聚類分析將13批雙黃連粉針劑分為2類，S1、S13為一類，S2～S12為一類，這與指紋圖譜相似度分析結(jié)果基本一致。

3 討論

本試驗將UPLC技術應用于雙黃連粉針劑的指紋圖譜研究，檢測時間僅需20 min，較HPLC分析[6]縮短了時間，同時大大提高了各色譜峰的分離度和靈敏度，減少了流動相的消耗[7]。

本研究通過建立13個批次雙黃連粉針劑指紋圖譜，對其中多個組分進行了研究，不限定域值，共有30個色譜峰。除11號峰后有一堆分離較差、峰形不對稱的色譜峰，會影響11號峰的分離度，其余色譜峰的分離度較好。同時對3個特征色譜峰的歸屬進行了定性分析，供試品溶液的色譜圖與對照圖譜基本一致，各色譜峰分離良好，色譜峰數(shù)量、保留時間與對照圖譜相同。

本研究較全面分析了雙黃連粉針劑指紋圖譜中所含的化學成分及主要藥效物質(zhì)基礎，相似度評價采用國家藥典委員會推薦使用的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》，該系統(tǒng)利用夾角余弦進行全譜圖計算，多點校正，結(jié)果可信。通過對13個批次雙黃連粉針劑的檢測和分析，結(jié)果表明各批次間穩(wěn)定性和一致性良好，為雙黃連粉針劑的全面質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] 張潔，馬百平，趙陽，等.雙黃連粉針劑指紋圖譜中特征色譜峰的組成藥味歸屬及定性[J].中成藥，2005，27（12）：1365-1369.

[2] 金高娃，章飛芳，薛興亞，等.超高效液相色譜在復雜體系中藥分離分析中的應用[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8（3）：106-108.

[3] 羅潔，范旭航，崔思嬌，等.知母的UPLC指紋圖譜及聚類分析[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2013，30（1）：28-31.

[4] 謝培山.色譜指紋圖譜分析是中草藥質(zhì)量控制的可行策略[J].中藥新藥與臨床藥理，2001，12（3）：141-151.

[5] 陳蓉，沈蓓，吳啟南.基于主成分分析和聚類判別模式對不同產(chǎn)地芡實HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2012，34（5）：781-783.

[6] 李方，姜文紅，劉麗娟，等.注射用雙黃連（凍干）指紋圖譜的建立及其在質(zhì)量控制中的應用[J].中成藥，2007，29（8）：1196-1198.

[7] 張翠英，董梁，陳士林，等.人參藥材皂苷類成分UPLC特征圖譜的質(zhì)量評價方法[J].藥學學報，2010，45（10）：1296-1300.

（收稿日期：2014-12-06；編輯：陳靜）