金茵利膽口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李彩東等

摘要：目的 建立金茵利膽口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)金茵利膽口服液中茵陳、蒲公英、枳殼、五味子進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法對(duì)該制劑中有效成分柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)行定量測(cè)定， Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。結(jié)果 薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。柚皮苷和新橙皮苷分別在0.56～5.60 μg（r=0.999 9）、0.38～3.80 μg（r=0.999 8）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.86%（RSD=2.04%）、98.95%（RSD=2.45%）。結(jié)論 本研究建立的定性定量檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為金茵利膽口服液的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：金茵利膽口服液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0087-04

金茵利膽口服液是蘭州市第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑（甘藥制字Z04010906），由茵陳、金錢草、蒲公英、黃連、枳殼、五味子等18味中藥提取加工而成，具有疏肝利膽、清熱解毒、行氣化瘀、理氣活血、利膽排石之功。該方在本院用于治療慢性肝炎、膽道感染、膽道結(jié)石、膽囊炎、黃疸等，在臨床使用已有20余年。為有效控制金茵利膽口服液的質(zhì)量，確保臨床用藥安全有效，本研究采用薄層色譜法（TLC）對(duì)處方中茵陳、蒲公英、枳殼和五味子進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其有效成分柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)行定量測(cè)定，并依此建立可靠、準(zhǔn)確穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；FA2004N型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠，型號(hào)HH-8；超聲波提取器，濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司，型號(hào)TH-100BQ。

對(duì)照品柚皮苷（批號(hào)110722-201111）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201102）、五味子甲素（批號(hào)110764- 201111），對(duì)照藥材茵陳（批號(hào)121555-201101）、蒲公英（批號(hào)121195-200902）、枳殼（批號(hào)120981- 201104）、五味子（批號(hào)120922-201309），中國(guó)食品藥品檢定研究院；金茵利膽口服液（批號(hào)130807、130904、131011）及缺茵陳、缺蒲公英、缺枳殼和缺五味子陰性對(duì)照樣品，蘭州市第二人民醫(yī)院制劑室自制；硅膠G板、GF254板，青島海洋化工廠；甲醇（色譜純），深圳西隴化工股份有限公司；磷酸（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水（自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 茵陳 取本品30 mL，用三氯甲烷振搖提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。取茵陳對(duì)照藥材1 g，加水40 mL，煎煮30 min，過濾，濾液同法制成茵陳對(duì)照藥材溶液。取缺茵陳的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為茵陳陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各5 μL，于同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮（6∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.2 蒲公英 取本品30 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次60 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取蒲公英對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成蒲公英對(duì)照藥材溶液。另取缺蒲公英的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為蒲公英陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各8 ?L，于同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.3 枳殼 取本品30 mL，加甲醇60 mL，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取枳殼對(duì)照藥材1 g，加水50 mL煎煮1 h，過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成枳殼對(duì)照藥材溶液。取缺枳殼的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為枳殼陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各5 ?L，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（4∶2∶0.15∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.4 五味子 取本品30 mL，加甲醇90 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取五味子對(duì)照藥材1 g，加水60 mL，煎煮1 h， 過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成五味子對(duì)照藥材溶液。另取五味子甲素，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺五味子的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為五味子陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，分別吸取上述4種溶液各6 ?L，于同一硅膠GF254薄層板上點(diǎn)樣，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同藍(lán)黑色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；以甲醇為流動(dòng)相B，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相A，梯度洗脫（0～35 min，20%→35%B；35～60 min，35%→80%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃[6]；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷真空干燥12 h的柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成濃度分別為柚皮苷280 μg/mL、新橙皮苷190 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得[7]。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺枳殼的陰性對(duì)照樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取柚皮苷和新橙皮苷混合對(duì)照品儲(chǔ)備液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，柚皮苷、新橙皮苷色譜分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾[7-8]。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、10、20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：柚皮苷Y=163 492X+4625.2，r=0.999 9；新橙皮苷Y=117 867X+8035.9，r=0.999 8。結(jié)果表明，柚皮苷和新橙皮苷分別在0.56～5.60 μg、0.38～3.80 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各20 μL，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，柚皮苷和新橙皮苷的色譜峰峰面積RSD分別為1.81%、1.77%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一金茵利膽口服液供試品（批號(hào)130807）溶液，分別于配制后0、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰面積RSD分別為2.74%、2.16%，結(jié)果表明在室溫條件下該供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批號(hào)（批號(hào)130807）樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰面積RSD分別為2.17%、2.59%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的本品（批號(hào)130807）9份，每3份1組，每份1 mL，每組中加入一定量的柚皮苷和新橙皮苷混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.3“項(xiàng)下方法制成低、中、高3個(gè)濃度的樣品溶液，分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，以外標(biāo)法測(cè)定柚皮苷和新橙皮苷含量[9]，結(jié)果見表1、表2。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 按“2.2.3”項(xiàng)下制備方法及“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定3批金茵利膽口服液樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[1-5]，經(jīng)多次試驗(yàn)，優(yōu)化篩選展開劑、顯色劑等檢測(cè)條件，對(duì)金茵利膽口服液中茵陳、蒲公英、枳殼、五味子進(jìn)行了薄層色譜鑒別。結(jié)果表明，所建立的薄層鑒別方法分離度好，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定金茵利膽口服液中柚皮苷和新橙皮苷含量的HPLC方法，該方法能將混合對(duì)照品及樣品中的2種有效成分良好分離。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]，考察比較了甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸及甲醇-磷酸不同濃度作為流動(dòng)相的分離效果。當(dāng)以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰形寬鈍；以乙腈-水、乙腈-磷酸為流動(dòng)相時(shí)，二者的色譜峰較低，分離度差；以甲醇-0.1%磷酸水體系為流動(dòng)相時(shí)，二者的色譜峰峰形良好，分離度高，無(wú)雜質(zhì)干擾，故選擇以甲醇-0.1%磷酸水為流動(dòng)相。對(duì)柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描后，發(fā)現(xiàn)在254 nm測(cè)定時(shí)，色譜峰峰形分離度良好。試驗(yàn)中還比較了Phenomenex 250 mm C18柱（菲羅門公司）和150 mm C18柱（島津公司）對(duì)2種成分的分離效果，在既定的色譜條件下，發(fā)現(xiàn)用250 mm C18柱時(shí)，柚皮苷和新橙皮苷的分離效果及峰形較好，故選用Phenomenex 250 mm C18柱。

結(jié)果表明，所建立的金茵利膽口服液TLC定性鑒別和柚皮苷及新橙皮苷的HPLC含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2014-10-29）

（修回日期：2014-11-18；編輯：陳靜）