香蕉MaPIP2—2基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達分析

侯曉婉　胡偉　顏彥　徐碧玉　金志強

摘 要 水通道蛋白（AQPs）是細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)水分運輸?shù)闹饕ǖ溃?對于植物細(xì)胞的水分穩(wěn)態(tài)和脅迫響應(yīng)具有重要作用。本研究從香蕉中克隆了一個水通道蛋白基因MaPIP2-2。序列分析結(jié)果表明，該基因的開放閱讀框（ORF）為846 bp，編碼281個氨基酸。多序列比對和進化樹分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白與其它植物中水通道蛋白具有較高的一致性，并且與擬南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3的親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位表明該基因定位在細(xì)胞膜上。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，該基因能夠在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)甘露醇、低溫、NaCl脅迫和ABA信號。這些結(jié)果表明MaPIP2-2可能參與了非生物逆境脅迫應(yīng)答，為進一步研究MaPIP2-2基因的功能鑒定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水通道蛋白；PIP；香蕉；克?。粊喖?xì)胞定位；熒光定量PCR

中國分類號 Q344.13 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Water channel protein，（Aquaporins， AQPs）， which was the main water transport corridor， plays a major role in maintaining water steady state and the stress response. In the present study， a AQP gene designated MaPIP2-2 from banana was isolated. MaPIP2-2 ORF was 846 bp， encoding 281 amino acids. Comparison of amino acid sequences and phylogenetic analysis indicated that MaPIP2-2 was closely related with AtPIP2-2 and AtPIP2-3. Subcellular localization assays showed that the MaPIP2-2 protein was present in the plasma membrane. Real-time quantitative polymerase chain reaction（QPCR）assay revealed that MaPIP2-2 participated in the response of abiotic stresses at transcriptional level. These results indicated that MaPIP2-2 might be involved in abiotic stress responses. The study would lay a foundation for further investigating the function of MaPIP2-2.

Key words Aquaporins； PIP； Banana； Cloning； Subcellular localization； Quantitative RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.014

水是生物體的主要組成部分，對生命至關(guān)重要。植物體的生長很大程度上取決于植物對水分的吸收和運輸，然而高鹽、干旱、低溫等環(huán)境脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)水分的缺失，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育[1]。香蕉作為世界第四大糧食作物，因其特有的淺根和需要大量水份維持的永久性綠色樹冠，對任何條件引起的水份缺失異常敏感[2]，因此研究香蕉如何響應(yīng)非生物脅迫顯得尤為重要。

水分在植物體不同組織之間的運輸主要是通過質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑[3]。水通道蛋白AQPs（Aquaporin， AQP）參與了水分共質(zhì)體途徑的運輸，負(fù)責(zé)水分的快速跨膜轉(zhuǎn)運，扮演著“細(xì)胞的水管工”，介導(dǎo)植物種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長、氣孔運動、韌皮部的裝卸及逆境應(yīng)答等多個生理過程[4-5]。AQP通過快速改變植物膜的通透性以應(yīng)對外界環(huán)境的變化，在植物對逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[6-7]。已有的報道表明，來自于水稻、小麥、擬南芥等多個物種的AQP家族基因能夠在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)非生物脅迫及相關(guān)信號分子，但香蕉中AQP家族基因功能的研究還非常有限。

水通道蛋白（AQP）屬于膜內(nèi)嵌蛋白MIP（a class of major intrinsic proteins，MIP）的一個大的亞家族，是由四聚體組成的沙漏狀結(jié)構(gòu)。由5個短環(huán)（A-E 環(huán)）連接的6個跨膜a-螺旋組成，其中B、D 環(huán)各有一段高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）元件，它們與其他跨膜區(qū)域共同形成通道[3，8-9]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和定位，AQP被分為4類，分別為質(zhì)膜內(nèi)嵌蛋白（the plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）、液泡膜內(nèi)嵌蛋白（the tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、小分子堿性膜內(nèi)嵌蛋白（the recently characterized small basic intrinsic proteins，SIPs）和類NOD 26膜內(nèi)嵌蛋白（the NOD-26-like intrinsic proteins，NIPs）[10-13]。

本研究從香蕉中克隆了一個MaPIP2-2基因，并對其在逆境脅迫以及ABA處理下的表達模式進行了研究。研究結(jié)果表明，克隆得到的MaPIP2-2基因編碼的蛋白具有AQP家族蛋白的基本特征；MaPIP2-2基因的表達能夠響應(yīng)非生物逆境脅迫及ABA信號。本研究的結(jié)果為進一步研究MaPIP2-2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 生長正常的五葉一心巴西蕉（Musa AAA Cavendish cv. Brazilian）幼苗取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州組培中心。

1.1.2 主要試劑 PEG6000、NaCl、ABA、AS、MES等生化試劑購自上海生工生物工程有限公司；氯仿、異戊醇等各種分析純試劑購自廣州化學(xué)試劑公司；限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；T4連接酶購自BioLab試劑公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA試劑生物公司，PCR試劑購自康為試劑生物公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 從香蕉A基因組測序數(shù)據(jù)庫中得到一個AQP家族基因，根據(jù)ORF序列設(shè)計一對引物（5'- CATGCCATGGCGATGTCGAAGGA

GGTCAGTGA-3'；5'-GGACTAGTGTTGGTGGGGTT

GCTCCG-3'）擴增MaPIP2-2 cDNA全長序列。PCR擴增程序為：變性，94 ℃，40 s；退火，55 ℃，40 s；延伸，72 ℃，1 min 30 s；共35個循環(huán)。擴增體系為20 μL體系：Mix，10 μL；Primer F，1 μL；Primer R，1 μL；cDNA，1 μL；ddH2O，7 μL。PCR擴增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進行PCR鑒定。對已鑒定的陽性克隆進行測序分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 在NCBI中利用BLASTX進行序列同源性分析，從中選取相似性較高的同源序列用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的多重比對。另外，為了確認(rèn)與其他物種中同源基因的親緣關(guān)系，利用MEGA軟件對擬南芥AQP基因家族和克隆出的MaPIP2-2基因一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 MaPIP2-2亞細(xì)胞定位分析 （1）瞬時表達載體構(gòu)建。根據(jù)目的基因MaPIP2-2序列設(shè)計帶有酶切位點NcoⅡ/SpeⅠ和不含終止子的載體引物：5'-CATGCCATGGCGATGTCGAAGGAGGTCAGTGA-3'；5'-GGACTAGTGTTGGTGGGGTTGCTCCG-3'。擴增產(chǎn)物回收后連接到克隆載體pMD18-T上，獲得重組質(zhì)粒，陽性克隆測序正確后，用NcoⅡ/SpeⅠ進行雙酶切并回收目的片段。同時，利用NcoⅡ/SpeⅠ雙酶切并回收的pCAMBIA1302載體大片段。利用T4連接酶將目的片段和載體片段進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，經(jīng)PCR和質(zhì)粒雙酶切驗證后，進行測序分析，從而成功構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP。將測序正確的陽性克隆的質(zhì)粒以及pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。

（2）農(nóng)桿菌法介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP和空載體（pCAMBIA1302-GFP）導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中[14]。隨后將洋蔥表皮放在鋪有濾紙的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)16～24 h，然后制作裝片，通過FluoViewTM FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1.2.4 基因表達分析 將生長一致的五葉一心巴西蕉分成4組，將第1組用300 mmol甘露醇（Mannitol）處理7、10、15、17 d；第2組用300 mmol NaCl處理8、12、24、32 d；第3組在8 ℃冷害下培養(yǎng)10、22、47 h，之后將處理47 h的幼苗置于人工氣候培養(yǎng)箱中恢復(fù)一周；第4組用100 μmol的ABA處理2、6、12、24 h。參照淦國英[15]改良的CTAB法提取每個處理時間點的香蕉葉片RNA，用自帶DNA消化酶的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，用TaRaKa公司的實時熒光定量PCR試劑盒中的SYBR Green、ROX染料進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)在吉泰生物科技有限公司Mx3005P熒光定量PCR儀上進行。以香蕉RPS2基因為內(nèi)參。定量方法為2-△△CT法：ΔΔCT=（CT， Target-CT， Actin）Timex-（CT， Target-CT， Actin）Time0[16]。設(shè)計引物參考TaKaRa實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)說明書。為了保證引物的特異性，引物設(shè)計在非翻譯區(qū)，PCR產(chǎn)物的長度維持在300 bp以內(nèi)，并進行了測序分析。設(shè)計引物完成后（MaPIP2-2-3F：5'-TCGGCTTTGCTGTGTTCA-3'；MaPIP2-6-3R：5'-TCAGTTGGTGGGGTTGCT-3'；MuRPS2F：5'-TAGGGATTCCGACGATTTGTTT-3'；MuRPS2 R：5'-TAGCGTCATCATTGGCTGGGA-3'），送上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR的反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaPIP2-2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)香蕉A基因組測序數(shù)據(jù)庫中的信息，從香蕉栽培品種巴西蕉中克隆到一個AQP家族基因，其ORF為846 bp，編碼281個氨基酸。從GenBank中選擇擬南芥的全部35個AQP家族成員及筆者所克隆的香蕉AQP基因的氨基酸序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明本研究克隆得到的AQP基因所編碼的氨基酸序列與AtPIP2-2和AtPIP2-3具有較近的親緣關(guān)系，蛋白序列比對表明它們之間的相似度分別為74.39%和73.68%，故將該基因命名為MaPIP2-2。BLASTX分析表明，MaPIP2-2編碼的氨基酸序列與姜花的HcPIP2（AEF32110.1）、海棗PdPIP2-6（XP_008809438.1）、桑樹MnPIP2-7（XP010107654.1）、可可TcPIP2-8（XP007041804.1）的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為93%、89%、88%和88%（圖2）。多序列比對分析表明，MaPIP2-2具有PIP亞家族蛋白的基本特征，其氨基酸序列有6個保守的跨膜螺旋，5個短環(huán)，1個高度保守的氨基酸序列‘HINPAVTFG和2個‘NPA元件。這些結(jié)果表明本研究克隆的MaPIP2-2為香蕉PIP亞家族的成員（圖2）。

2.2 MaPIP2-2蛋白的亞細(xì)胞定位分析

以構(gòu)建的MaPIP2-2基因的植物表達載體pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將其和空載體（pCAMBIA1302-GFP）導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，對MaPIP2-2蛋白在植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布進行研究。激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號在細(xì)胞內(nèi)的分布，結(jié)果顯示35S∶GFP綠色熒光蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有表達，35S∶MaPIP2-2-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達（圖3）。這一結(jié)果表明MaPIP2-2蛋白定位在細(xì)胞膜上。

2.3 MaPIP2-2基因在非生物逆境脅迫及ABA處理下的表達分析

利用實時熒光定量PCR對MaPIP2-2基因在NaCl、甘露醇（Mannitol）、低溫、ABA處理下的表達模式分析的結(jié)果表明，在NaCl處理下，與對照相比較，MaPIP2-2基因的表達在處理8～24 d顯著被誘導(dǎo)了1.3～2.3倍（圖4-A）。在甘露醇處理下，與對照相比較，MaPIP2-2基因的表達在處理7～17 d被抑制（圖4-B）。在低溫處理下，與對照相比較，MaPIP2-2基因的表達在處理10 h被顯著誘導(dǎo)了2倍，達到最大值2.076 68，隨后逐漸下降（圖4-C）。在ABA處理下，MaPIP2-2基因的表達在處理2 h時被顯著誘導(dǎo)，隨后在處理6 h時卻又下降到1.127 14，而在處理6～24 h時逐漸升高并達到最大值3.759 61，與對照相比較，ABA處理下，MaPIP2-2基因整體呈顯著誘導(dǎo)趨勢（圖4-D）。

3 討論與結(jié)論

近年來水通道蛋白（AQP）家族基因的功能已經(jīng)廣泛被報道，但是關(guān)于香蕉中水通道蛋白（AQP）家族基因的研究非常有限。本研究從香蕉中克隆了一個AQP基因（MaPIP2-2），該基因編碼的氨基酸序列具有AQP家族蛋白的基本特征，與其它物種中AQP家族成員具有較高的一致性，與擬南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3具有較近的進化關(guān)系。亞細(xì)胞定位分析表明，MaPIP2-2定位于細(xì)胞膜上，與MaPIP1；1和TaAQP7等AQP基因的細(xì)胞定位結(jié)果一致[1，18]，進一步說明了MaPIP2-2具有PIP蛋白的特征。因此，可以推測本研究所克隆的基因是AQP家族中PIP亞類中的一個成員。

大量的研究表明AQP家族基因能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)水分的平衡，保持植物細(xì)胞水分穩(wěn)態(tài)，并且能夠快速響應(yīng)環(huán)境脅迫，在植物對逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究運用實時熒光定量PCR的方法研究了香蕉MaPIP2-2基因在轉(zhuǎn)錄水平對甘露醇、低溫、高鹽和ABA信號的應(yīng)答。結(jié)果表明，在高鹽和ABA處理下，MaPIP2-2基因的表達趨勢基本一致，均被顯著誘導(dǎo)。這一結(jié)果與在高鹽處理下香蕉MaPIP1；1、小麥TaNIP和TaAQP8基因的表達趨勢一致，同時小麥TaNIP、TaAQP8被證實能夠增強轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性[1，18-19]；而在ABA處理下的表達趨勢與水稻OsPIP1-1、OsPIP1-2、OsPIP2-1、OsPIP2-3、OsPIP2-4和OsPIP2-5的一致，同時水稻OsPIP1-1被證明能夠顯著提高植物對高鹽和干旱的耐受性[20]。這些結(jié)果表明一些水通道蛋白家族成員在高鹽和ABA處理下發(fā)揮著正向調(diào)控作用。因此，MaPIP2-2基因可能在植物響應(yīng)高鹽脅迫和ABA信號過程中起著重要作用。

在甘露醇處理下，MaPIP2-2基因的表達被顯著抑制。這一結(jié)果與Guo等[20]報道的PEG6000處理下水稻葉片中OsPIP2-4和根系中OsPIP1-2，OsPIP1-3，OsPIP2-2的表達趨勢一致。在低溫處理下，MaPIP2-2基因的表達被早期誘導(dǎo)，表明巴西蕉對低溫脅迫的響應(yīng)較為敏感，在處理初期就能達到最大值。這一結(jié)果與Huang等[21]研究的TaAQP7在低溫脅迫下的研究結(jié)果一致，而TaAQP7在煙草中過表達增強了轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性[17]。因此，MaPIP2-2基因可能參與了植物對低溫和甘露醇的耐受過程。

綜上所述，MaPIP2-2基因編碼的蛋白具備PIP亞家族蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征，是AQP家族中PIP亞類的一個成員。MaPIP2-2基因能夠在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)甘露醇、低溫、NaCl和ABA信號，這些結(jié)果表明MaPIP2-2能夠參與非生物逆境脅迫應(yīng)答，并在其中發(fā)揮重要作用。為進一步研究MaPIP2-2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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