Fusarium mangiferae侵染對凱特杧內源激素含量的影響

柳鳳　歐雄?！≌踩辶帧№f繼光　常金梅

摘 要 為探討杧果感染畸形病過程中頂芽內源激素含量的變化規(guī)律，以凱特杧為試驗材料，測定了接種病菌（Fusarium mangiferae）后頂芽內生長素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量的變化情況。結果表明：接種病菌后，杧果頂芽內赤霉素和生長素含量急速上升，且在整個試驗階段明顯高于健康處理，脫落酸含量在試驗后期不斷升高；分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn). mangiferae侵染能夠顯著影響杧果頂芽內源激素的含量，改變IAA/ABA和GA3/ABA的平衡，致使杧果的生長發(fā)育受到影響，進而引發(fā)畸形病的產生。

關鍵詞 杧果；畸形?。籉usarium mangiferae；內源激素

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

Abstract In order to study the effect of pathogens causing malformation on the endogenous hormone contents in Mangifera indica Keitt， we detected the changes of IAA， GA3 and ABA contents in buds affected by Fusarium mangiferae. The results showed that the contents of endogenous IAA and GA3 rose rapidly and were significantly higher than the control at at whole period after inoculation； ABA content rose at the late period after inoculation. The pathogens could affect the contents of IAA， GA3 and ABA in mango significantly and disturbed the balance of IAA/ABA and GA3/ABA， which affected the growth and development of mango， related to the mango malformation disease causing.

Key words Mangifera indica； Mango malformation； Fusarium mangiferae； Endogenous hormone

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.009

病原菌的入侵會強烈干擾植物體的正常代謝，內源激素作為植物體內重要的微量信號分子，必不可少的參與此過程，內源激素作為抗性因子，啟動或抑制與抗病相關蛋白的基因表達，起到誘導或阻遏抗病性的產生，最終表現(xiàn)出感病或抗病[1-3]。脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和生長素（IAA）是調節(jié)植物細胞生長代謝的重要內源激素，在植物生長發(fā)育中充當著重要而又復雜的角色，其含量及變化規(guī)律決定著細胞與組織的生長狀況[4]。正常生長情況下，這些內源激素之間處于某種動態(tài)平衡狀態(tài)，調節(jié)植物的生長發(fā)育[5]。病原物的入侵打破了植物體內各種內源激素之間原有的平衡狀態(tài)，改變了各種內源激素之間的比值，從而使植株生長量減小，生長勢弱，很快發(fā)生病變，甚至衰亡[6-7]。杧果畸形病是一種危害杧果正常生長的世界性病害，植株感病后嫩葉變細而脆，嫩芽、花序簇生，最后干枯，因此杧果染病后幾乎不座果。國內該病主要分布在云南、四川海拔較高的杧果晚熟地區(qū)[8-10]。有研究報道患病組織的形成與杧果內源激素的失調有著十分密切的關系，但關于病原菌接種后杧果內內源激素含量的變化情況目前還無人測定[11]。本研究以中國杧果晚熟地區(qū)主栽品種‘凱特杧為材料，通過比較人工接種F. mangiferae后，健康與接種杧果內內源激素含量的差別，旨在闡明F. mangiferae侵染對杧果內源激素含量變化的影響，豐富杧果畸形病病原菌的致病機理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗設病原菌接種處理和健康（對照）兩組。供試MG06菌株為杧果畸形病病原菌F. mangiferae。以健康的一年生凱特杧實生苗為材料，采用組織塊接種法接種。將病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落邊緣打孔，取直徑0.8 cm的菌餅作為接種體。利用解剖刀在頂芽下1～2 cm處刺傷，將菌餅菌絲面貼于刺傷處，保濕培養(yǎng)。每間隔5 d接種1次，共接種5次作為平行試驗。接種0、15、30、45、60、75、90和105 d后取樣。每處理每次取15個芽，在液氮冷凍中磨成粉狀進行混勻，分開包裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 內源激素的提取與純化 每次取1.0 g杧果頂芽粉狀物加10 mL提取液（80%色譜級甲醇，內含1 mmol/L的BHT二叔丁基對甲苯酚），4 ℃過夜后離心，沉淀中加5 mL提取液抽提2 h，收集所有的上清液測定總體積，37 ℃減壓蒸發(fā)甲醇，留水相，之后加0.2 g的PVPP吸附酚類及色素，震蕩10 min后離心取上清液，往上清液中加入等體積石油醚脫色2次，留水相，冰乙酸調pH至2.5～2.9，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，減壓蒸干，用2 mL甲醇溶解。過C-18柱固相萃取柱進行純化，具體步驟是：80%甲醇（1 mL）平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗柱→循環(huán)。將過柱后的樣品轉入5 mL塑料離心管中，真空濃縮干燥，加1.5 mL甲醇溶解，過0.45 μm有機系針頭式過濾器過濾，1.5 mL棕色液相上機瓶收集濾液，備用。

1.2.2 標準溶液的配制 將IAA、GA3、和ABA 3種標準樣用色譜級甲醇溶解，分別配置為100 mg/L標準溶液，再將上述3種溶液配置成混合標準溶液待用。

1.2.3 標準曲線的制備及回收率測定 將各種激素標樣在1.2.4的色譜條件下分別進樣，進樣量分別為5、10、15、20、25、30和35 μL。記錄保留時間，以此確定為標樣的出峰時間。采用峰面積外標法定量測定，以濃度Y（mg/L）為縱坐標，峰面積X（mV/s）為橫坐標，計算得到各激素的標準曲線和相關系數(shù)。準確稱取一定質量的標樣，按1.21樣品處理方法處理，根據(jù)加入量和檢出量計算回收率，3次平行試驗驗證。

1.2.4 色譜條件 色譜儀為島津（Shimadzu）高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp高壓泵，SPD-10Avp檢測器，CTO-10ASvp柱溫箱，C-R8A積分儀；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.6%乙酸（50 ∶ 500 ∶ 450）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量10 μL。

1.3 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的處理和分析均采用Microsoft Excel2003 軟件及SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和Duncans（鄧肯氏）多重差異比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制備及回收率測定

在選定的色譜條件下測得的赤霉素（GA3）保留時間為（3.361±0.050）s，線性回歸方程為y=58.921x-19 489（R2=0.996 0），回收率為80.4%；生長素（IAA）保留時間為（5.155±0.061）s，線性回歸方程為y=852.14x-31 248（R2=0.998 8）回收率為81.3%；脫落酸（ABA）保留時間為（7.374±0.049）s，線性回歸方程為y=498.2x-38 003（R2=0.999 2）回收率為87.3%。

2.2 生長素（IAA）含量變化規(guī)律測定

杧果健康對照組與F. mangiferae接種處理組頂芽內IAA含量的變化趨勢相同（圖1），均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，但F. mangiferae接種組頂芽內生長素含量上升趨勢明顯高于對照組，且這種差異隨著時間的延長逐漸加大。處理組頂芽內的生長素在接種病原菌15 d后即顯著高于健康對照組，接種病原菌60～90 d內含量達到最高，約為1 700 ng/g FW，是對照組（約為700 ng/g FW）的2.5倍左右，接種病原菌105 d時，內源生長素含量雖略下降，但是仍顯著高于健康對照組。

2.3 赤霉素（GA3）含量變化規(guī)律測定

從圖2中可以看出，杧果受F. mangiferae感染后，其頂芽內源赤霉素GA3含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，接種病原菌45 d達到最大值，約為415.65 ng/g FW，是空白對照組（86.4 ng/g FW）的4.8倍，45 d后其含量略下降，但仍顯著高于健康對照組。

2.4 脫落酸（ABA）含量變化規(guī)律測定

杧果頂芽內源脫落酸的含量在F. mangiferae侵染后變化趨勢與生長素和赤霉素有所不同，接種病原菌60 d內無顯著變化，隨之迅速提高，接種病原菌105 d達到最大，為3 214.4 ng/g FW，是接種初期和對照組的2.6倍左右（圖3）。

2.5 病原菌侵染后杧果內源激素比值的變化

植物激素間的生理效應既相互促進又相互拮抗，任何一類植物激素可影響到生長發(fā)育的多個過程，同樣，植物生長發(fā)育是多種激素相互作用的結果。IAA和GA3能促進植物生長，延緩衰老，而ABA則促進植物衰老，其比值通常用來表示植物內源激素對生長的作用是促進還是抑制。從表1可以看出，在整個試驗階段，健康杧果頂芽內IAA/ABA和GA3/ABA基本呈現(xiàn)上升趨勢，而處理組IAA/ABA和GA3/ABA出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且前期上升幅度遠大于健康對照組，后期又低于對照處理。由此推斷，F(xiàn). mangiferae侵染能夠改變杧果頂芽內IAA/ABA和GA3/ABA的平衡，致使杧果的生長發(fā)育受到影響，進而引發(fā)畸形病的產生。

3 討論與結論

脫落酸、赤霉素和生長素是調節(jié)植物細胞生長代謝的重要內源激素，在植物生長發(fā)育中充當著重要而又復雜的角色，其含量及變化決定著細胞與組織的生長狀況。在植物體正常生長情況下，內源激素處于某種動態(tài)平衡狀態(tài)，調節(jié)植物的生長發(fā)育。當病原物入侵植物體后，內源激素原有的動態(tài)平衡被打破，從而使植株生長發(fā)育受到影響，進而產生病害。高增貴等[12]采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，測定玉米苗期接種絲黑穗病菌后植株體內生長素、赤霉素、玉米素核苷和脫落酸4種內源激素的含量變化，從寄主與病菌互作過程中植物內源激素的變化研究玉米對絲黑穗病的抗性機制。研究結果表明，玉米絲黑穗病菌侵染玉米植株后，植株體內單一激素ABA含量提高；IAA、GA3和ZR的含量降低；IAA/ABA、ZR/ABA、GA3/ABA及（IAA+GA3+ZR）/ABA的比值均明顯低于對照。趙錦等[13]用高效液相色譜法分別對健株、感病棗樹內源激素的含量進行了測定，結果表明植原體侵染棗樹植株后致使其內源激素失衡，主要是細胞分裂素含量的增加，最終導致了棗瘋病癥狀表現(xiàn)。

將病原菌回接到杧果嫩梢上結果顯示，45 d之后接種頂芽處形成大量凸起小芽包，75 d后凸起的芽包大量萌發(fā)，后期150 d萌發(fā)大量新芽，約是空白對照的7～9倍，且新葉細小生長緩慢，與對照相比節(jié)間偏短，與典型的枝葉畸形相同。本研究結果表明，F(xiàn).mangiferae侵染后杧果頂芽內IAA、GA3和ABA的含量均有不同程度的提高，但提高幅度和病害的發(fā)展程度存在一定的相關性。病害發(fā)生初期，IAA和GA3含量迅速提高，刺激了杧果頂芽的迅速生長，形成大量新芽，然后由于頂芽的過度生長，植株營養(yǎng)狀況的供給不足，因此形成的芽簇生葉片變細變脆。病害發(fā)生后期，ABA的含量迅速上升，頂芽長勢病變，是組織衰老死亡的征兆。從內源激素比例中也可以看出，在供試試驗階段，健康對照組內IAA/ABA、GA3/ABA的比例呈逐漸上升的趨勢，但是總體上升幅度不大。而接種處理組中，接種病原菌45 d時，GA3/ABA的比值高達0.320，約是健康處理組的5倍左右，接種病原菌60 d時，IAA/ABA的比值為1.428，健康處理組僅為0.572，GA3/ABA和IAA/ABA比值的增高促進了杧果頂芽的徒長。當接種病原菌105 d，接種病原菌的杧果頂芽內GA3/ABA和IAA/ABA比值均比健康處理組低，顯示了杧果組織開始處于衰老和死亡的狀態(tài)，然而杧果頂芽內的內源激素這種變化究竟是由病原菌侵染直接造成的，還是病原菌誘導了細胞損傷或影響了杧果頂芽同化作用后所造成的，還有待深入研究。

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