內(nèi)源激素對橡膠樹花藥體細胞胚發(fā)生的影響

張慧君　葛宇　楊先鋒

摘要：以巴西橡膠樹花藥為外植體，對巴西橡膠樹再生過程中不同類型愈傷組織的內(nèi)源激素含量及比值進行測定。結果表明：過高或過低的內(nèi)源激素含量和不同內(nèi)源激素含量比，大多會導致橡膠樹外植體在分化過程中出現(xiàn)非胚性愈傷和畸形胚，因此橡膠樹花藥體細胞胚再生過程與其內(nèi)源激素密切相關。

關鍵詞：橡膠樹；花藥；再生；體細胞胚；內(nèi)源激素

中圖分類號： S794.105 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0239-03

高等植物體細胞胚發(fā)生是離體生長發(fā)育中一個復雜的科學問題，受內(nèi)外多種因素的影響，目前人們尚未掌握其離體發(fā)育規(guī)律。植物離體培養(yǎng)過程中植物激素起著重要的調(diào)控作用，它們的調(diào)控是引起各細胞組織和器官分化的基礎，從而維持植物正常的離體發(fā)育過程，植物激素對形態(tài)發(fā)生起著重要的作用，外植體離體培養(yǎng)形態(tài)建成往往需要很多外源激素的誘導[1-2]。對于植物離體培養(yǎng)中體細胞胚發(fā)育過程，只有胚性愈傷才能形成正常胚，畸形胚難以形成正常的組培苗，這種情況嚴重制約了組培苗工廠化的生產(chǎn)和育種的應用。因此，本試驗對橡膠樹花藥組織培養(yǎng)過程中非胚性愈傷和胚性愈傷、畸形胚和正常胚不同內(nèi)源激素含量進行研究，對建立高效巴西橡膠樹體細胞胚再生體系以及種質資源保存具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料以巴西橡膠樹優(yōu)良無性系熱研7-33-97花藥為外植體，花藥培養(yǎng)參照Hua 等的方法[3]，然后分別取培養(yǎng)60 d的胚性愈傷組織（簡稱a）、非胚性愈傷組織（簡稱b）、子葉胚時期的正常胚（簡稱c）和畸形胚（簡稱d）用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2 方法

內(nèi)源激素的測定采用酶聯(lián)免疫法，采集4種類型材料，重復3次，1次10個樣品材料，于液氮中速凍；用80%甲醇溶液勻漿，4 ℃提取8 h，4 000 r/min離心15 min；沉淀用80%甲醇提取，重復3次；合并上清液，然后用氮氣吹干，由中國農(nóng)業(yè)大學生物技術實驗室提供測試服務，每個指標的測定均重復3次。

應用DPS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Excel 2007作圖。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)源激素含量的變化

如圖1所示，在花藥愈傷再生過程中，ZT在非胚性愈傷組織（b）和畸形胚（d）中含量相對較高，在胚性愈傷組織（a）和正常胚（c）中含量相對較低；IAA在畸形胚中含量最高，在非胚性愈傷組織中含量最低；ABA在非胚性愈傷組織中含量最高，在畸形胚中含量最低；GA3含量在各組織中變化趨勢與ZT相似，在非胚性愈傷組織和畸形胚中含量相對較高，在胚性愈傷組織和正常胚中含量較低。

2.2 內(nèi)源激素比值的變化

在花藥愈傷再生過程中，不同內(nèi)源激素含量比值在4種愈傷組織中是不同的（圖2）。IAA/ZT、IAA/GA3和IAA/ABA的含量比在非胚性愈傷組織（b）中最低，ZT/ABA和GA3/ABA的含量比在畸形胚（d）中最低；IAA/ZT、IAA/ABA和GA3/ABA的含量比在胚性愈傷組織（a）中最高，IAA/GA3和ZT/ABA的含量比分別在畸形胚（d）和非胚性愈傷組織中最高。

3 討論與結論

許多學者研究表明，在植物離體細胞發(fā)育過程中，生長素類物質起重要作用，比如啟動細胞分裂和誘導胚性潛力，從而促進外植體早期發(fā)育，所以說植物體的各種生理效應是內(nèi)源激素相互作用的結果[4-5]。研究表明，細胞分裂素6-BA可以誘導水稻花藥等愈傷組織以不定芽的形態(tài)分化，由愈傷組織形成的出苗率與內(nèi)源生長素存在負效應，出苗率與內(nèi)源細胞分裂素存在正效應。這說明一些植物愈傷組織在植物激素作用下所分化的不定芽是受外界誘導從而自身產(chǎn)生的內(nèi)源激素所影響的，已經(jīng)可以滿足外植體不定芽生長發(fā)育的需要[5-6]，再添加其他植物激素反而適得其反。邢登輝等研究表明，體細胞胚發(fā)生過程中，黃冠草體胚IAA含量分別在培養(yǎng)10、25 d后達到峰值[7]，這與朱麗華等在大白菜和桑下胚軸愈傷組織不定芽發(fā)生過程中的結果[8-9]類似。前人的研究說明愈傷組織的形成與內(nèi)源IAA關系密切。賴鐘雄等發(fā)現(xiàn)，龍眼的胚性愈傷組織內(nèi)源IAA含量比非胚性愈傷組織高，從早期的胚性愈傷組織發(fā)育到早期子葉胚的過程，其內(nèi)源IAA含量都維持在較高水平，并且在胚性愈傷組織和球形胚2個時期出現(xiàn)高峰，而球形胚時期后IAA含量降低[10]。本研究中，從花藥體胚的不同愈傷組織的IAA含量來看，胚性愈傷組織和正常胚相對于非胚性愈傷組織較高，與前人的結果一致，這可能與愈傷組織形成有關。前人研究表明，胡蘿卜再生過程中GA3含量高可能會抑制其體胚發(fā)生。2，4-D抑制體胚發(fā)育是通過維持高含量GA3來進行的，當減少2，4-D含量時，GA3迅速降到適合體胚發(fā)育的含量。同樣本研究發(fā)現(xiàn)，GA3在非胚性愈傷和畸形胚中含量相對較高，在胚性愈傷和正常胚中含量較低?？梢娫谙鹉z樹花組織培養(yǎng)過程中，形成正常胚時GA3的含量較低，而在非愈傷組織、畸形胚中相對較高。ZT含量與GA3的變化趨勢相同，但變化幅度較大，都是在胚性愈傷和正常胚中含量較低?？梢?，要想獲得更多的橡膠樹花藥組培苗須降低內(nèi)源ZT的含量。

通常細胞分裂素與生長素含量比越小越有利于不定根分化，反之有利于不定芽分化。此外，IAA/ABA比是影響植物再生的關鍵因素。Berry等的研究表明，不定芽產(chǎn)生的愈傷組織內(nèi)IAA與ABA含量比小于1[11-12]。本研究結果表明，在正常胚中IAA/ABA的比最高，說明橡膠樹花藥離體培養(yǎng)時，較高的IAA/ABA含量比有利于正常胚的形成。上述結果進一步表明，植物生長調(diào)節(jié)劑在植物體內(nèi)的調(diào)控作用并不決定于某單一激素，往往都是一種或者幾種以上的激素通過聯(lián)合或拮抗作用共同調(diào)節(jié)的結果[13-15]?？傊?，植物內(nèi)源激素在橡膠樹體細胞胚發(fā)生和發(fā)育過程中起到重要的作用，過高或過低的4種內(nèi)源激素含量和不同內(nèi)源激素含量比，大多會導致橡膠樹外植體在分化過程中出現(xiàn)非胚性愈傷和畸形胚。但至今仍不知道這些激素通過何種途徑來調(diào)控巴西橡膠樹的作用機制，關于畸形胚及其形成原因以及降低畸形胚發(fā)生率的措施等有待于進一步研究。

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