靈發(fā)素（LFS）對誘導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中內(nèi)源激素含量的影響

梁瓊月++周鳳玨++許鴻源++覃柳蘭++何麗珊++何冰

摘 要 以半夏葉柄為材料，比較MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（CK）和MS+LFS 0.3 mg/L（Lingfasu，LFS，靈發(fā)素）2種培養(yǎng)基在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和發(fā)育過程中內(nèi)源激素的變化差異。結(jié)果表明：在半夏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和發(fā)育過程中，2個處理組內(nèi)源激素變化趨勢，除ABA大致呈“M”狀外，IAA、GA3和ZR激素大致呈“∧”狀；在半夏體胚發(fā)生的重要時期（胚性愈傷組織時期和早期胚時期），LFS處理組中IAA和ABA的含量顯著高于CK組，ZR在早期胚時期高于對照29.0%，GA3含量以CK組含量較高。此結(jié)果表明，LFS對半夏體細(xì)胞胚胎的發(fā)生和發(fā)育過程中內(nèi)源激素IAA、ZR、ABA和GA3的調(diào)控起著重要作用。

關(guān)鍵詞 半夏 ；靈發(fā)素（LFS） ；體細(xì)胞胚胎 ；內(nèi)源激素

中圖分類號 Q945 ；R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.010

Effects of Angustmycin A on Endogenous Hormone Content of

Pinellia ternata（Thunb）Briet during Somatic Embryogenesis

LIANG Qiongyue ZHOU Fengjue XU Hongyuan QIN Liulan HE Lishan HE Bing

（Agricultural Collage， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530005）

Abstract The petiole of Pinellia ternata was cultured on the MS+BA 2.0+NAA 0.1（CK） and MS+Angustmycin A 0.3， respectively to observe difference in the change of the endogenous hormones during somatic embryogenesis and embryo development. The result showed that during the somatic embryogenesis and embryo development of P. ternata Briet the endogenous hormones in the two treatment groups tended to showed a "∧" curve for IAA， GA3 and ZR but a "M" curve for ABA. During the important stage of embryogenesis （embryonic callus stage and early embryo development stage）， the treatment with the presence of Angustmycin A in the MS had higher IAA and ABA content， higher ZR content （29.0% higher）， and higher GA3 content than the control. This indicated that Angustmycin A played an important role in regulating the endogenous hormones IAA， ZR， ABA and GA3 in the process of somatic embryogenesis and embryo development of P. ternata.

Keywords Pinellia ternata Briet ； Angutmycin A ； somatic embryo ； endogenous hormone

半夏[Pinellia ternata（Thunb）Briet]是天南星科半夏屬的一種多年生草本植物，為中國傳統(tǒng)中藥材，以塊莖入藥，主要功效為潤燥化痰、降逆止嘔等[1]。因市場需求不斷擴(kuò)大，野生半夏被過度采摘，資源匱乏，而人工栽培效率不高，因此，組織培養(yǎng)成為擴(kuò)大半夏繁殖、解決半夏資源緊缺問題的有效途徑。植物體細(xì)胞胚胎是獲得人工種子和再生植株，并進(jìn)行植物快繁的重要材料。因此，高效優(yōu)質(zhì)地獲得植物體細(xì)胞胚胎已成為近年植物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿[2-3]。植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物體組織培養(yǎng)細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素。但前人都是以6-BA、NAA、2，4-D等數(shù)種常用植物生長調(diào)節(jié)劑復(fù)配而成的多種類、多因素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)過復(fù)雜的生產(chǎn)程序，才能獲得體細(xì)胞胚胎，生產(chǎn)效率較低。LFS為（Lingfasu，靈發(fā)素，代號PGR-08，亦稱狹霉素）同時具有細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CTK）和生長素（Auxin）2大類植物激素生物活性的植物生長調(diào)節(jié)劑[4-5]，在植物體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)中表現(xiàn)出其特有的優(yōu)勢。許鴻源等[6]利用LFS的這一特性建立了簡單高效生產(chǎn)半夏體細(xì)胞胚胎和再生組培苗技術(shù)。同時，LFS單一培養(yǎng)基，已經(jīng)成功建立了三七[7]、翅子羅漢果[8]和羅漢果[9-11]等名貴中藥材組培再生苗簡單高效的生產(chǎn)方法。而有關(guān)LFS對誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中外植體內(nèi)源激素含量的影響機(jī)制尚未見報道。本研究以LFS簡單高效誘導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎發(fā)生，并結(jié)合其發(fā)育過程中激素含量的動態(tài)變化情況，探討半夏培養(yǎng)物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)理，為有效指導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎的形成提供理論參考，同時為中草藥、林木和花卉等植物組織培養(yǎng)繁殖再生苗提供新的技術(shù)支持，在學(xué)術(shù)理論和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐上都具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

LFS為本實(shí)驗室自備重結(jié)晶品，純度≥98%。半夏原始外植體為廣西藥用植物園提供，經(jīng)鐘仕強(qiáng)主任中藥師鑒定為Pinellia ternata（Thunb）Briet。參考許鴻源等[6]的方法，用其球莖獲得無菌苗，在超凈工作臺上切取2 cm左右的無菌葉柄段，作為外植體材料進(jìn)行體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制及外植體培養(yǎng)條件

MS為基本培養(yǎng)基，以添加許鴻源等[6]優(yōu)選出的誘導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎最佳濃度LFS 0.3 mg/L（單位下同）為處理，并以張愛民等[12]和薛建平等[13]研究的常規(guī)誘導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)基MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為對照（CK）進(jìn)行研究。處理和對照均添加蔗糖30 g/L和瓊脂4.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.8～6.0，常規(guī)滅菌20 min，備用。培養(yǎng)條件：晝/夜溫度[（28 ～22℃）±2]℃；光照強(qiáng)度為1 500 lx，10 h/d。共進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)接種50瓶，每瓶5個葉柄。

1.2.2 取樣

在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生期間，分別取外植體、胚性愈傷組織、早期胚、成熟胚和幼苗5個階段的鮮樣各0.8 g左右（圖1），并立即用液氮處理， 貯存于-80℃冰箱中，用于激素含量的測定。

1.2.3 內(nèi)源激素的提取、純化和測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別測定吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）4種激素的含量（以鮮重表示），測定方法參照何鐘佩[14]的方法，略有修改，激素測定試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化學(xué)控制實(shí)驗室。在4℃低溫室內(nèi)用80%甲醇（內(nèi)含1 mmol/L二叔丁基對甲苯酚BHT）研磨成勻漿， 4℃提取4 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀再用80%甲醇提取液提取1 h，再次離心，然后合并上清液，并過C18固相萃取柱。氮?dú)獯蹈?，樣品稀釋液（NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、明膠、Tween-20）定容，用ELISA法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA含量的變化

IAA含量的高低直接影響到體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。本試驗IAA含量的變化情況見圖2，CK組與LFS組，由外植體至早期體胚形成，IAA含量圴逐漸升高，之后隨著體胚的成熟和萌發(fā)成苗，IAA含量又逐漸下降。在整個過程中，除幼苗階段外，LFS組中的IAA含量均高于CK組，尤其是早期胚階段LFS組中的IAA含量高出CK組80.7%。這說明LFS處理對IAA的積累具有顯著影響，對胚性細(xì)胞的啟動與早期發(fā)育具有重要的意義。

2.2 ZR含量的變化

由圖3可知，在體胚發(fā)生和發(fā)育過程中，從外植體分化至胚性愈傷組織時期，2個試驗組ZR含量均急劇上升至峰值，然后LFS組中的ZR含量呈直線下降，CK組下降緩慢，直至成熟胚時期急劇下降。在峰值時期LFS組中的ZR含量高于CK組29.0%，這說明外植體在脫分化形成胚性愈傷組織時，合成并積累了大量的ZR，利于細(xì)胞的增值和分裂，從而誘導(dǎo)體胚的正常發(fā)育，增加單個外植體體胚發(fā)生的數(shù)量，這對高效獲得體細(xì)胞胚胎極其重要。

2.3 ABA含量的變化

由圖4可知，在體胚發(fā)生和發(fā)育過程中，ABA含量呈波浪形變化，先是胚性愈傷組織升高到一峰值，接著早期胚時期降到一低谷，然后成熟胚時期又急劇上升到一最高峰，幼苗時期再降低。除成熟胚時期外，整個發(fā)育過程中LFS組中的ABA含量均高于CK組。這對抑制體胚早期萌發(fā)和畸形胚的形成，防止裂生多胚的現(xiàn)象，從而保證體胚的健康發(fā)育及萌發(fā)成苗。

2.4 GA3含量的變化

由圖5可知，各時期GA3含量呈對稱分布。在體胚發(fā)生過程中，GA3含量逐漸上升，到早期胚時期達(dá)到最大值，再逐漸降低。在整個體胚發(fā)生過程中，除了外植體和幼苗時期外，CK組中的GA3含量均高于LFS組，尤其是早期胚時期，高出63.4%。低水平的GA3含量利于體胚的發(fā)育[15]，無疑LFS組對有效誘導(dǎo)半夏體胚更優(yōu)于CK組。

3 討論

植物體細(xì)胞分化為胚性細(xì)胞必須具備相應(yīng)的誘導(dǎo)因子，諸多因素中植物激素的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)是最重要的調(diào)節(jié)因素之一[16]。眾多研究結(jié)果報道表明，不同的植物所使用的激素種類大不相同，有的植物必須通過生長素與細(xì)胞分裂素聯(lián)合使用，而有的植物只使用生長素或細(xì)胞分裂素便可形成體細(xì)胞胚。如苜蓿的分化誘導(dǎo)須同時具備生長素和細(xì)胞分裂素的作用[2]；紅豆草則僅需適量BA即可分化誘導(dǎo)[17]。本課題組采用LFS單一培養(yǎng)基相繼直接成功地誘導(dǎo)了名貴中藥材半夏[6]、三七[18]等植物體細(xì)胞胚胎的發(fā)生及發(fā)育，而且實(shí)現(xiàn)了高效優(yōu)質(zhì)。本課題組前期研究結(jié)果表明，以半夏為材料，LFS比傳統(tǒng)的BA+NAA配比能更高效地誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生和發(fā)育，本研究驗證了這一結(jié)果是因為它對體胚發(fā)生發(fā)育過程中內(nèi)源激素的有效調(diào)節(jié)，利于細(xì)胞的分裂增值及體胚的早期發(fā)育，抑制畸形胚的形成，防止裂生多胚的不利現(xiàn)象，從而促進(jìn)體胚的健康發(fā)育及萌發(fā)成苗[6]。

本研究結(jié)果證明，LFS單一培養(yǎng)基與常規(guī)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)基BA+NAA復(fù)配相比，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育至成苗整個過程中，內(nèi)源IAA、ZR、ABA和GA3的含量變化與前人[19-20]在不同植物上采用不同調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的結(jié)果相似。水稻（Oryza sativa）胚性細(xì)胞出現(xiàn)時伴隨有較高的內(nèi)源IAA水平[2]；龍眼（Dimocarpus longan）胚性細(xì)胞發(fā)生過程中IAA含量在球形胚時期達(dá)到最大值，隨后顯著下降[19]；黃姜（Dioscorea zingiberensis Wright）胚性細(xì)胞產(chǎn)生的高峰期IAA達(dá)最大值，隨后下降[20]。 ZR和GA3的含量變化與前人對皇冠草（Echinodorus orisis）胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果一致，即球形胚時期和早期胚時期最大[2]。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）體細(xì)胚發(fā)生早期ABA含量增加，體胚整齊一致，長勢較好，與本研究結(jié)果一致[21]；ABA對枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生后期影響較大，促進(jìn)體胚的成熟[22]。內(nèi)源激素通過調(diào)節(jié)和控制體細(xì)胞胚胎發(fā)育的相關(guān)基因的開啟和閉合而影響體胚一系列代謝過程，最終影響到細(xì)胞胚性潛力的誘導(dǎo)、維持和表達(dá)[23]，因此，內(nèi)源激素含量的高低是影響植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素。內(nèi)源激素的含量可通過外源因子進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)節(jié)，而外源誘導(dǎo)因子可是單一化合物，也可是不同化合物組成的復(fù)雜體。因此，在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生時，選擇一個適合的外源誘導(dǎo)因子是一項極其重要而復(fù)雜的工作。

綜上所述，LFS能較體細(xì)胞胚胎常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L更優(yōu)質(zhì)高效地誘導(dǎo)半夏體細(xì)胞胚胎的發(fā)生和發(fā)育，LFS對體胚發(fā)生和發(fā)育過程中的關(guān)鍵時期內(nèi)源激素IAA、ABA和ZR的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)效果更顯著，其機(jī)理可能是通過調(diào)控內(nèi)源激素間接的調(diào)控相關(guān)基因的活動，從而影響一系列代謝過程，保證了半夏體胚的誘導(dǎo)與萌發(fā)，為人工種子的研究制作奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國醫(yī)科學(xué)院藥物研究所. 中藥志（第2冊第2版）[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：38-42.

[2] 李 明，王樹香，馮大領(lǐng). 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生及發(fā)育研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（3）：237-241.

[3] 何承忠，許昌慧，孟 瑜，等. 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理生化研究進(jìn)展[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報，2009，29（3）：78-82.

[4] 許鴻源. 狹霉素在植物學(xué)和農(nóng)學(xué)上的應(yīng)用[J]. 中華人民共和國知識產(chǎn)權(quán)局發(fā)明專利公報，2003，19（34）：6.

[5] 許鴻源，許鴻章，楊美純，等. PGR-08理化性質(zhì)及生物活性的研究[J]. 廣西植物，2003，23（5）：461-463.

[6] 許鴻源，梁瓊月，解云英，等. 用靈發(fā)素建立簡單高效生產(chǎn)半夏胚狀體與組培苗的方法[J]. 種子，2010，29（9）：79-81.

[7] 許鴻源，蒙愛東，何 冰，等. 三七葉器官獲得胚狀體和再生植株的研究[J]. 中國中藥雜志，2007，3（6）：481-483.

[8] 宋 磊，許鴻源，周鳳玨，等. 用靈發(fā)素（LFS）建立翅子羅漢果組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 種子，2008，27（12）：12-14.

[9] 許鴻源，周鳳玨，何 冰，等. LFS，N6-BA和KT在羅漢果組織培養(yǎng)中不同的生物效應(yīng)[J]. 種子，2006，25（8）：4-6.

[10] 劉曉燕，許鴻源，陳 亮，等. LFS和CPPU在羅漢果組培中生物效應(yīng)的對比研究[J]. 種子，2007，26（9）：15-17.

[11] Lan T J， Xu H Y， He B. Effects of cytokin ins on tissue culture of Siraitia grosvenorii（Swingle） C. Jeffrey， asweetening plant[J]. Sugartech， 2009， 11（3）：311-314.

[12] 張愛民，楊生玉，薛建平，等. 多種因素對半夏外植體直接誘導(dǎo)形成試管小塊莖的影響[J]. 中國中藥雜志，2005，30（8）：576-579.

[13] 薛建平，張愛民，盛 瑋，等. 鉀鹽對半夏試管塊莖誘導(dǎo)的影響[J]. 中國中藥雜志，2006，31（7）：546-548.

[14] 何鐘佩. 農(nóng)作物化學(xué)控制實(shí)驗指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993：60.

[15] 崔凱榮，邢更生，周功克，等. 植物激素對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[J]. 遺傳，2000，22（5）：349-354.

[16] 鄧正正，王力華，王慶禮. 植物生長調(diào)節(jié)劑對水曲柳組培苗生長及內(nèi)源激素的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，37（12）：10-13.

[17] Burrell A M， Lineberger R D， Keerti S R， et al. Genetic variation in somatic embryogenesis of rose[J]. Hortcience，2006，41（5）：1 165-1 168.

[18] 許鴻源，蒙愛東，李春霞，等. 靈發(fā)素對三七胚狀體發(fā)生及其成苗的影響[J]. 中藥材，2004，27（10）：711-712.

[19] 賴鐘雄，陳春嶺. 龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)源激素變化[J]. 熱帶作物學(xué)報，2002，23（2）：41-47.

[20] 向景葵，黃 哲. 黃姜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素含量變化的研究[J]. 岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2006，21（1）：62-64.

[21] 唐靜儀. 蔗糖和ABA對鐵皮石斛體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響[D]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[22] 崔凱榮，裴新梧，秦 林，等. ABA對枸杞體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)節(jié)作用[J]. 實(shí)驗生物學(xué)報，1998，31（2）：1995-1999.

[23] 崔凱榮，戴若蘭. 植物體細(xì)胞胚發(fā)生的分子生物學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2000：48-64.

① 基金項目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No.2012ZX09301002-001-018）； 國家“863”專項經(jīng)費(fèi)（No.2006AA10A213）。

收稿日期：2016-05-10；責(zé)任編輯/黃東杰；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 梁瓊月（1987～），女，碩士，實(shí)驗師；主要研究方向為植物生理，E-mail： 132xiaoyue@163.com。

③ 通訊作者：何 冰（1974～），女，博士，副教授；主要研究方向為植物逆境生理，E-mail： bingh2000@126.com。