植物葉綠體SOD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與功能研究進(jìn)展

郭懷攀　佘文琴

摘要 對(duì)葉綠體SOD的遺傳分類、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程以及SOD在葉綠體中的功能進(jìn)行綜述分析。葉綠體SOD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與銅分子伴侶（CCS）及Cu離子濃度密切相關(guān)。不同Cu離子濃度能夠使不同類型SOD在葉綠體中選擇性表達(dá)；在植物葉綠體中，SOD還可以進(jìn)行電子傳遞、調(diào)節(jié)電子轉(zhuǎn)移以及保護(hù)光合作用等。研究SOD缺失突變體及超表達(dá)對(duì)植物的影響，對(duì)分析SOD的功能具有重要意義。

關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶；活性氧；脅迫；葉綠體

中圖分類號(hào)：S184 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-381-04

植物體在自然狀態(tài)下和各種生物脅迫時(shí)均會(huì)有活性氧（ROS）產(chǎn)生。植物體自身有著較完善的抑制活性氧產(chǎn)生和活性氧清除機(jī)制，能夠有效地清除活性氧。而在復(fù)雜的自然環(huán)境中，植物體可能會(huì)受到干旱、鹽漬、高溫、冷凍、重金屬離子、空氣污染、病蟲(chóng)害等逆境脅迫，此時(shí)機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧。由于植物體內(nèi)活性氧代謝能力有限，活性氧積累，從而產(chǎn)生氧化脅迫。在植物體內(nèi)，超氧化物歧化酶（SOD）在對(duì)抗活性氧對(duì)細(xì)胞膜透性的破壞與保護(hù)細(xì)胞膜完整性方面有著重要作用。SOD作為活性氧代謝的首要防線，參與O-2等超氧陰離子轉(zhuǎn)化成O2和H2O2的分解反應(yīng)[1]。然后，在過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）以及抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等的協(xié)同作用下，活性氧完全分解。

SOD在植物體內(nèi)普遍存在，幾乎在所有需氧生物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。SOD是一種多聚體金屬蛋白。根據(jù)酶活性中心金屬輔基的不同，可分為Cu/Zn SOD（CSD），F(xiàn)e SOD（FSD），Mn SOD（MSD）和Ni SOD（NSD）4類。 綠色植物SOD主要包括前3種；Ni SOD被發(fā)現(xiàn)較晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)[2]。從遺傳進(jìn)化關(guān)系上，F(xiàn)SD是最為原始的SOD，黃褐色，分子結(jié)構(gòu)為四聚體結(jié)構(gòu)，分子量80～90 kDa，在酶活性中心有2～4個(gè)Fe離子[3]；MSD與FSD在一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上高度相似，金屬結(jié)合位點(diǎn)的保守殘基相同[4]，被認(rèn)為可能由FSD進(jìn)化而來(lái)，不同的是其活性中心只有一個(gè)金屬離子，顏色為紫紅色；CSD與前兩種SOD差異較大，可能是單獨(dú)進(jìn)化而來(lái)，為二聚體結(jié)構(gòu)，分子量32～65 kDa，顏色也為紫紅色[3]。植物自身防護(hù)機(jī)制限制了有害物質(zhì)在不同細(xì)胞器之間的運(yùn)輸，帶電的O-2離子無(wú)法通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。這就要求SOD分布在不同細(xì)胞器間隔中進(jìn)行活性氧清除，保護(hù)各細(xì)胞器代謝不受O-2離子的危害[3]。大量的研究表明，CSD 是分布較廣泛也是最主要的一種，位于植物細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、過(guò)氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體以及胞外間隙；FSD主要位于葉綠體中；MSD則位于線粒體基質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中[5-6]。植物通過(guò)各種細(xì)胞器間SOD酶的廣泛分布以及與其他酶的協(xié)同作用來(lái)共同確保植物細(xì)胞膜的完整性。

1 植物SOD基因克隆與遺傳進(jìn)化關(guān)系

1.1 植物SOD基因的分子克隆 植物SOD基因的克隆開(kāi)始于20世紀(jì)80年代。早期的一些克隆主要有玉米、擬南芥、水稻等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對(duì)SOD基因克隆及轉(zhuǎn)化表達(dá)工作已進(jìn)行了大量研究，每年都有上千條SOD基因得到克隆驗(yàn)證。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，在Nucleotide中搜索“superoxide dismutase”，已登錄的SOD核酸序列（mRNA）就有十多萬(wàn)條，主要是細(xì)菌和原核生物，其中綠色植物僅2 583條，綠色植物的克隆中絕大多數(shù)是有花植物。植物SOD基因的克隆為植物抗逆性等基因工程研究奠定了基礎(chǔ)。植物SOD基因家族的多態(tài)性可能是由植物體對(duì)于復(fù)雜環(huán)境的應(yīng)對(duì)機(jī)制引起的，不同類型的SOD在抵御逆境時(shí)扮演著不同角色[5]。與其他物種相比，植物體SOD基因種類較多，由多個(gè)基因分別編碼，編碼方式相對(duì)復(fù)雜。各種SOD在亞細(xì)胞中的定位不同，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列也不一樣，并且同一亞細(xì)胞中也會(huì)存在多種SOD，如葉綠體中就同時(shí)存在CSD和FSD。植物體內(nèi)SOD序列具有很高的同源性，且相較于其他生物，SOD基因內(nèi)含子數(shù)目與位置具有高度保守性。在內(nèi)含子數(shù)量上，植物體內(nèi)核基因組中質(zhì)胞型CSD的內(nèi)含子有7個(gè)[7]；葉綠體型的有8個(gè)，玉米葉綠體型CSD內(nèi)含子略有不同，只有7個(gè)[7]；MSD基因一般含5個(gè)內(nèi)含子[8]，F(xiàn)SD內(nèi)含子為6～8個(gè)[9]。

1.2 SOD遺傳進(jìn)化關(guān)系 植物SOD基因家族具有多態(tài)性，可能是由植物體對(duì)于復(fù)雜環(huán)境的應(yīng)對(duì)機(jī)制引起的。不同類型的SOD在抵御逆境中扮演著不同角色。與其他物種相比，植物體SOD基因的編碼方式相對(duì)復(fù)雜，由多個(gè)基因編碼。在各種SOD在亞細(xì)胞中的定位不同，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列也不一樣。通過(guò)對(duì)來(lái)自23個(gè)物種的SOD不同類型基因序列（圖1）的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)各類型SOD在不同的植物間具有很高的保守性；FSD與MSD序列相對(duì)接近，具有共同進(jìn)化來(lái)源，而CSD與它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不同亞細(xì)胞分布的CSD之間的差異并不明顯，如葉綠體CSD中三角葉楊CSD序列與質(zhì)胞型的歐洲山楊CSD序列比較接近。

2 葉綠體SOD的表達(dá)與調(diào)控

2.1 葉綠體SOD基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程 所有植物的SOD基因序列都是由細(xì)胞核基因組編碼的，因此這些由80S核糖體轉(zhuǎn)錄合成的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過(guò)跨膜運(yùn)輸來(lái)送達(dá)葉綠體。植物葉綠體中主要存在CSD和FSD 2種SOD。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉綠體中主要是FSD1、FSD2、FSD3和CSD2，其中FSD1的表達(dá)量最高。在葉綠體SOD基因的翻譯表達(dá)過(guò)程中，除FSD1外，其他SOD有專一的可分裂的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列，可以結(jié)合SOD經(jīng)TOC/TIC通道蛋白穿過(guò)細(xì)胞器膜，最終將SOD運(yùn)送到葉綠體基質(zhì)中[10]。緊接著，葉綠體基質(zhì)中的蛋白酶使得葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列分裂釋放SOD，完成SOD的運(yùn)輸過(guò)程。Jarvis[10]認(rèn)為，TOC/TIC通道蛋白具有很強(qiáng)的解折疊能力，推測(cè)被結(jié)合的SOD應(yīng)該處于伸展?fàn)顟B(tài)。因此，SOD酶的折疊加工與金屬輔基的裝配過(guò)程應(yīng)該在基質(zhì)中進(jìn)行。而FSD酶絡(luò)合Fe離子的過(guò)程尚不明確。銅分子伴侶（Chaperone for Cu/Zn Superoxide dismutase，CCS）在CSD的合成過(guò)程中起到傳遞銅離子的作用，其氨基末端具有銅離子結(jié)合位點(diǎn)，中心區(qū)域與其靶蛋白CSD酶相似，并且具有額外的半胱氨酸殘基的羧基末端結(jié)構(gòu)域，使得銅離子與CSD亞基之間通過(guò)二硫鍵相連，從而激活CSD酶的活性[11]。然而，F(xiàn)SD1作為擬南芥葉綠體SOD中最重要的一種，缺少一個(gè)相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)序列[12]，F(xiàn)SD1的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程以及之后的進(jìn)一步修飾也有待進(jìn)一步的研究。

2.2 Cu離子對(duì)葉綠體SOD表達(dá)的調(diào)控 銅離子調(diào)節(jié)機(jī)理的研究已經(jīng)十分深入，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子啟動(dòng)子結(jié)合蛋白SPL7。SPL7是在植物中的Cu響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子[13]，其功能是在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)Cu離子的平衡。在低Cu離子濃度下，SPL7直接與小RNAmiR398啟動(dòng)子的GTAC序列結(jié)合，激活miR398表達(dá)[13]。miR398能夠降解編碼CSD的mRNA，從而抑制CSD的表達(dá)。同時(shí)，Cu離子還是CSD和銅分子伴侶CCS不可缺少的金屬輔基。在高的Cu離子濃度下，CSD大量表達(dá)，F(xiàn)SD表達(dá)幾乎完全被抑制[14]，可能是植物將Fe離子用在其他物質(zhì)的合成；在低的Cu離子濃度下，CSD和CCS的表達(dá)被抑制，F(xiàn)SD的活性被激活[15]，同時(shí)Cu離子被優(yōu)先靶向轉(zhuǎn)移到類囊體內(nèi)腔中合成質(zhì)體藍(lán)素[16]。這說(shuō)明Cu離子對(duì)不同類型SOD在葉綠體中的表達(dá)具有選擇性。外源Cu離子對(duì)轉(zhuǎn)CSD、CCS基因的擬南芥突變體中FSD和CSD轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)一步表明，葉綠體基質(zhì)中的銅離子含量調(diào)節(jié)這些核基因的表達(dá)[17]。因此，植物葉綠體中可能存在一種信號(hào)途徑來(lái)感知Cu離子濃度，從而影響植物細(xì)胞核中SOD基因的表達(dá)。

2.3 脅迫對(duì)SOD基因表達(dá)的影響 擬南芥葉綠體SOD在各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均保持著較高的表達(dá)水平[12]。這說(shuō)明葉綠體型SOD在SOD基因家族中扮演著重要角色。在不同的脅迫處理下CSD和FSD的表達(dá)情況已有較多的研究。主要是外源金屬離子脅迫如Cu、Fe、Zn、As、Mn等離子[18]，光照脅迫如弱光、紫外光[19]，溫度脅迫如高溫、低溫[20]，環(huán)境脅迫如干旱、鹽漬[21]，還有外源激素處理如ABA、GA3等[22]。干旱、滲透脅迫和外源ABA都會(huì)引起葉綠體基質(zhì)的閉合，影響光合作用中CO2的輸送，在光照條件下基質(zhì)中的光化還原反應(yīng)過(guò)度還原，從而積累大量的過(guò)氧化物質(zhì)[23]。大多數(shù)植物位于上述脅迫環(huán)境下都會(huì)引起SOD的上調(diào)表達(dá)。這顯然與SOD的活性氧清除功能有關(guān)。大多數(shù)處理[24-26]對(duì)葉綠體CSD和質(zhì)胞CSD的表達(dá)影響基本上是一致的，表現(xiàn)為同時(shí)上調(diào)表達(dá)，少數(shù)情況[27]表現(xiàn)為同時(shí)下調(diào)。而脅迫對(duì)FSD表達(dá)的影響不甚相同，在有些情況下為上調(diào)，有時(shí)為下調(diào)表達(dá)，F(xiàn)SD的表達(dá)機(jī)理有待明確[22]。一些外源物質(zhì)可以引起SOD基因的差異表達(dá)，如鹽脅迫條件下水稻幼苗CSD、MSD等抗氧化酶基因表達(dá)量增加，但在外源脯氨酸和海藻糖的作用下使這些基因表達(dá)量下調(diào)，甚至低于沒(méi)有進(jìn)行脅迫處理的幼苗[28]。SOD在金屬離子產(chǎn)生的過(guò)氧化脅迫中起著重要作用[29]。錳離子的毒害作用在短期內(nèi)可以使得黑麥草不同亞型SOD基因產(chǎn)生差異性表達(dá)，就整體而言表達(dá)量趨勢(shì)是上升的[30]。

3 葉綠體SOD功能

葉綠體SOD在植物光合作用過(guò)程中起著重要作用，主要是活性氧的清除，可以進(jìn)行電子傳遞保護(hù)正常光合作用以及調(diào)節(jié)電子轉(zhuǎn)移與信號(hào)傳遞的作用。

3.1 活性氧的清除 葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所。在葉綠體中類囊體中，光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心是活性氧的主要生成部位。早在1951年，Mehler[31]就發(fā)現(xiàn)了PSⅠ光化還原反應(yīng)將O2轉(zhuǎn)化成H2O2的反應(yīng)過(guò)程。光合作用的原初光化學(xué)反應(yīng)與一系列的氧化還原反應(yīng)相銜接。

2H2O→4e-+O2+4H+（PSII）

2O2 +2e- →2O-2（PSI）

2O2-+2H+→2H2O2+O2（SOD）

H2O2 +AsA→2H2O+MDA（APX）

這一系列由光化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電子的傳遞過(guò)程，起始物和終止物都有水的存在，因此被稱為W-W循環(huán)（Water-water cycle）[32]。W-W循環(huán)起到激能傳遞的作用，同時(shí)能夠使得光化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧得以有效清除。PSⅠ反應(yīng)中心復(fù)合物是由多個(gè)膜蛋白組成的超分子復(fù)合物，將電子傳遞給H2O形成超氧陰離子[33]，PSⅡ和質(zhì)體醌同樣會(huì)產(chǎn)生活性氧[23]。植物葉綠體中存在超過(guò)20種Fe-S蛋白[34]，而PSⅠ是還原鐵硫中心的光系統(tǒng)，其中心為Fe-S簇。有研究表明，其復(fù)合物蛋白中的Fe-S簇對(duì)過(guò)氧化物高度敏感，易使其功能喪失[34]，同時(shí)具有類似結(jié)構(gòu)的FSD1也有可能會(huì)喪失酶活性[22]。類囊體外膜的表面被認(rèn)為是超氧化物產(chǎn)生的主要位置，用免疫標(biāo)記電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)葉綠體的CSD緊密地靠近類囊體外膜的表面，與PSⅠ相接近，可能是由于CSD靠近PSⅠ光反應(yīng)位點(diǎn)會(huì)更有效地將活性氧清除[35]。

3.2 保護(hù)光合作用與電子傳遞 植物體自身存在一系列光系統(tǒng)保護(hù)體系。在葉綠體中，光合作用中的光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）易受到光化還原過(guò)程中過(guò)多激發(fā)能的刺激而產(chǎn)生光抑制作用[36]，影響植物正常的光合作用。在高光或高CO2濃度條件下，W-W循環(huán)并不能夠有效地轉(zhuǎn)移激發(fā)能，此時(shí)非光化學(xué)猝滅（NPQ）和光呼吸過(guò)程可能更有效[23]。W-W循環(huán)并非電子傳遞的主要方式。有研究表明，在正常的光合作用條件下，W-W循環(huán)電子傳輸估計(jì)值不到總電子傳輸量的10%[23]。然而，超表達(dá)的FSD在線粒體中會(huì)使通過(guò)W-W循環(huán)傳輸電子量顯著增加，尤其在強(qiáng)光與低溫環(huán)境條件下[37]。在煙草中，F(xiàn)SD的超表達(dá)會(huì)改善除草劑甲基紫精處理引起的光抑制作用[38]，在擬南芥中FSD2/FSD3的超表達(dá)也具有同樣的效果[12]。SOD在保護(hù)光合作用中起到的作用是有限的，對(duì)擬南芥CSD2的mRNA進(jìn)行修飾表達(dá)使其成為抗miR398，從而提高其表達(dá)量。通過(guò)觀察擬南芥在高光、重金屬以及甲基紫精處理下CSD2的表達(dá)情況，了解其抗脅迫的能力，結(jié)果只有在相對(duì)苛刻的處理?xiàng)l件下才能觀察到處理與對(duì)照之間的差異[39]。

3.3 SOD功能缺失對(duì)植物的影響 值得探討的是，葉綠體SOD功能的一些線索還不是很明確。通過(guò)研究SOD的表達(dá)模式以及影響這些酶表達(dá)的幾個(gè)因素，可以尋找這些線索，如SOD的表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及各種環(huán)境因素產(chǎn)生的影響，包括非生物脅迫和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。關(guān)于SOD功能最直接的證據(jù)來(lái)自于SOD表達(dá)缺失的突變體。擬南芥CCS缺失突變體在葉綠體和胞液沒(méi)有檢測(cè)到SOD活性。這表明CCS是SOD表達(dá)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。CCS缺失突變體生長(zhǎng)即便在高濃度的Cu離子環(huán)境中，仍會(huì)缺乏這FSD和CSD活性[40]。然而，CCS缺失并沒(méi)有產(chǎn)生植物表型的變化，而且在高光脅迫下也沒(méi)有檢測(cè)到其對(duì)光合作用產(chǎn)生影響。這些結(jié)果表明，CSD不是光合抗氧化劑體系中的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，只是限制了CSD的合成。在這一過(guò)程中，植物可能存在其他活性氧清除機(jī)制，如APX在葉綠體中起著比SOD更重要的作用[41]。而葉綠體CSD缺失突變體會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受抑制，葉綠體變小，同時(shí)光合作用能力降低[42]。在一種藍(lán)藻菌中，發(fā)現(xiàn)FSD缺失突變體會(huì)對(duì)光反應(yīng)氧化脅迫敏感[43]。這說(shuō)明SOD在葉綠體光合作用中具有不可低估的作用。

4 總結(jié)

葉綠體SOD在植物體內(nèi)除了清除活性氧外，還可以進(jìn)行電子傳遞，保護(hù)正常光合作用以及信號(hào)傳遞等。SOD在植物體內(nèi)的功能可能遠(yuǎn)不止這些。葉綠體作為植物體內(nèi)SOD種類和含量較多的部位，葉綠體SOD的功能顯然與光合作用的部分過(guò)程密切相關(guān)。研究SOD缺失突變體或SOD基因的超表達(dá)并結(jié)合植物表現(xiàn)型的分析能夠更好地探討SOD的功能，并且發(fā)現(xiàn)更多SOD其他方面的應(yīng)用。

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