黃連素對阿爾茨海默病模型大鼠的保護作用

孫 鈿

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 宜昌 443000)

黃連素(BC)是乙酰膽堿酯酶抑制劑。以往報道表明BC能夠調(diào)節(jié)β樣淀粉蛋白生產(chǎn)過程中的β分泌酶的活性，但是BC在阿爾茨海默病(AD)模型中的具體作用機制尚不明確〔1～4〕。本實驗探討B(tài)C在同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的AD模型的作用。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠3～4月齡，(280±20)g購買自武漢大學(xué)動物實驗中心。SD大鼠隨機地分為空白對照組、模型組和治療組，每組11只。模型組大鼠尾靜脈注射 Hcy(400 μg·kg－1·d－1)，治療組同時灌胃給予黃連素(50 mg·kg－1·d－1)。空白對照組給予生理鹽水，連續(xù)造模14 d。

1.2 試劑 Hcy和黃連素購自美國Sigma公司。過氧化氫酶(CAT)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自美國R＆D公司。Western印跡抗體購自美國Protein Tech公司。

1.3 Morris水迷宮 Morris水迷宮被用來檢測SD大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力。水迷宮由一個內(nèi)壁直徑為150 cm的黑色的圓形水池組成，劃分成4個象限，在第3象限(目標(biāo)象限)放置有一個直徑為30 cm的透明的平臺，該平臺位于水面下1厘米，迷宮及平臺位置保持不變。在每次實驗中，大鼠從1、2、4象限中點放入水池，訓(xùn)練大鼠找到平臺，記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏期)，如果大鼠在60 s內(nèi)沒有找到平臺，則引導(dǎo)大鼠到平臺上并在平臺上停留20 s。通過一個攝像頭，和連接著的數(shù)字跟蹤設(shè)備采集大鼠的潛伏期和運動軌跡。訓(xùn)練6 d，第7天撤掉平臺，檢測大鼠到達(dá)平臺位置的時間及穿越平臺所在位置的次數(shù)。

1.4 CAT、GSH-Px活性檢測 大鼠經(jīng)麻醉處死后，迅速稱取海馬組織，使用電動勻漿器將海馬組織放在生理鹽水中研磨成10%的組織勻漿液，經(jīng)過3 000 r/min離心10 min，取上清液體，生理鹽水稀釋成1%的勻漿液，按試劑盒說明書進行操作。CAT活性在405 nm處檢測吸光度值，GSH-Px活性在412 nm處檢測吸光度值。

1.5 免疫印跡 10%SDS-PAGE膠電泳，通過濕式轉(zhuǎn)移法將PAGE膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液(碧云天公司)封閉1 h，特異性一抗4℃孵育過夜，T-TBS漂洗3次后，使用HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h，采用ECL顯色，并分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對AD大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的影響 隨訓(xùn)練時間的推移，各組大鼠的潛伏期都逐漸縮短，學(xué)習(xí)、記憶能力逐漸增強。模型組和空白對照組比較，其潛伏期顯著變長(P＜0.05);和模型組比較，治療組的潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，見表 1、表 2。

2.2 BC對AD大鼠CAT、GSH-Px活性的影響 見表3。與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織中CAT、GSH-Px的活性均顯著下降(P＜0.05)。經(jīng)BC處理后，治療組大鼠的海馬組織中CAT、GSH-Px的活性均明顯提高，(P＜0.05)。

2.3 BC對AD大鼠神經(jīng)亡凋亡的影響 Hcy能夠誘導(dǎo)SD大鼠海馬發(fā)生凋亡，模型組caspase顯著激活，而抗凋亡分子bcl-2表達(dá)則明顯下降(P＜0.05)，見圖1。相對灰度值比較見表4。

表1 各組SD大鼠學(xué)習(xí)期間的潛伏期比較(x±s，n=11，s)

表2 各組SD大鼠記憶檢測結(jié)果比較(x±s，n=11)

表3 各組SD大鼠海馬組織的CAT、GSH-Px活性(x±s，n=4)

圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

表4 各組凋亡相關(guān)蛋白相對灰度值(x±s，n=4)

3 討論

血漿中高Hcy已經(jīng)被認(rèn)為是AD的一個危險因素〔5〕。高Hcy血癥的模型小鼠表現(xiàn)出許多AD樣的病理變化，例如認(rèn)知功能障礙，血腦屏障完整性的破壞，谷氨酸毒性，氧自由基紊亂，tau蛋白過度磷酸化以及β淀粉樣蛋白沉積〔6〕。通過尾靜脈注射Hcy已經(jīng)被廣泛應(yīng)用作AD的動物模型，用來研究AD的發(fā)病機制〔7〕。BC，又稱為小檗堿，是毛茛科植物根莖中的一種異喹啉類生物堿。BC有著廣泛的藥理作用，在心腦血管系統(tǒng)中黃連素具有抗心律失常，抗心力衰竭，抗高血壓，保護腦血管的作用。血液系統(tǒng)中，BC具有抗血小板聚集，降血脂，降血糖，改善胰島素抵抗，抗氧化應(yīng)激，抗腫瘤等多種作用〔8～10〕。神經(jīng)系統(tǒng)中，BC能夠調(diào)節(jié)β分泌酶的活性，該酶在β樣淀粉蛋白生產(chǎn)過程中起重要作用。本研究結(jié)果表明BC還可以改善模型大鼠抗氧化應(yīng)激能力，提高模型大鼠抗凋亡能力。

綜上，本研究表明BC可以改善AD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，其作用機制可能是通過提高AD模型大鼠的抗氧化應(yīng)激能力和抗凋亡能力來實現(xiàn)的。

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