苗藥九仙羅漢接骨湯干預(yù)對(duì)兔骨折模型的病理染色變化及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的作用

楊彥君 熊 屹 唐良華 易洪城 程志剛 敬 戈

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨二科，貴州 貴陽 550003)

中醫(yī)藥治療骨折具有減輕疼痛、消腫、縮短療程、功能恢復(fù)好等特點(diǎn)。苗藥九仙羅漢接骨湯由仙桃草、九節(jié)茶、地羅漢三味苗藥組成，具有活血散瘀通絡(luò)，接骨消腫止痛之功效〔1〕。本研究探討苗藥九仙羅漢接骨湯促進(jìn)骨折愈合不同時(shí)相點(diǎn)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌雄各半新西蘭大耳白兔120只，體重為2.5～3.0 kg，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 九仙羅漢接骨湯煎劑:由地羅漢、仙桃草、九節(jié)茶組成。按傳統(tǒng)方法煎煮，制備所需濃度的煎劑，保存?zhèn)溆?。三七?將三七粉溶于水后滅菌備用，含生藥0.02 g/ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 人抗兔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、即用型S-P免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);南美胎牛血清(貴陽愛瑞生物有限公司提供)。

1.4 造模 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物造?！?〕。新西蘭大白兔右脛骨前部中段用線鋸造成寬3 mm深2 mm的骨缺損，深度達(dá)髓腔，生理鹽水沖洗，青霉素16萬U撒入創(chuàng)面預(yù)防感染，術(shù)畢縫合傷口，不予外固定。術(shù)畢分籠飼養(yǎng)，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食、水和自由活動(dòng)。術(shù)后3 d每日早晚給予青霉素40萬U肌注抗感染。

1.5 分組及給藥 新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組:接骨湯組，三七對(duì)照組，生理鹽水組。①接骨湯組:灌胃給苗藥九仙羅漢接骨湯煎劑(1 ml/kg)。②三七對(duì)照組:灌胃給同體積三七粉液(1 ml/kg)。③生理鹽水組:灌胃給同體積生理鹽水。所有動(dòng)物于骨折當(dāng)天開始給藥，術(shù)后7、14、21、28 d分批處死，每組各10只。

1.6 動(dòng)物取材和標(biāo)本處理 給藥試驗(yàn)后于7、14、21、28 d，各組動(dòng)物按時(shí)間段在兔耳緣靜脈空氣注射處死動(dòng)物，截取骨折中心上下各1 cm脛骨骨干，中性甲醛固定，用于HE及VEGF表達(dá)檢測(cè)。

1.7 方法

1.7.1 HE染色檢測(cè) 以骨缺損處為中心取長度約1 cm的脛骨骨干，將其置于40 g/L多聚甲醛溶液4℃下固定脫鈣〔3〕。HE水洗，藍(lán)化，中性樹膠封固。切片后用200倍光學(xué)顯微鏡觀察HE染色結(jié)果。

1.7.2 VEGF表達(dá)檢測(cè) 采用武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的VEGF免疫組化，S-P試劑盒對(duì)標(biāo)本VEGF的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢查。石蠟塊作縱向間斷連續(xù)切片(3μm)，脫蠟后經(jīng)甲醇雙氧水封閉內(nèi)源性酶，南美胎牛血清封閉非特異性染色，ABC法檢測(cè)骨痂組織中VEGF表達(dá)。使用即用型S-P免疫組化試劑盒，標(biāo)本經(jīng)一抗、二抗、ABC復(fù)合物處理，DAB顯色后DPX封片，鏡檢，10×40倍顯微鏡下觀察，呈棕色著色為VEGF陽性表達(dá);每個(gè)標(biāo)本再在10×10倍光鏡下隨機(jī)抽取3個(gè)視野作陽性表達(dá)計(jì)數(shù)，以3個(gè)視野計(jì)數(shù)均值作為各標(biāo)本VEGF表達(dá)的計(jì)量指標(biāo)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)檢查 切片檢查可見九仙羅漢接骨湯組兩骨端生長新骨的時(shí)間較早，范圍大，軟骨內(nèi)成骨過程較快，兩端骨髓腔較早形成連接，28 d骨髓腔已完全貫通。三七對(duì)照組及生理鹽水組兩骨端出現(xiàn)新骨的時(shí)間較晚，軟骨區(qū)范圍較大，軟骨內(nèi)成骨過程時(shí)間長，骨痂生長相對(duì)緩慢，直到28 d兩端骨髓腔未能連接。根據(jù)Lane-Sandhu〔4〕組織學(xué)評(píng)分法，對(duì)各組組織學(xué)光鏡下所見進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，見表1。

表1 Lane-Sandhu組織學(xué)檢查評(píng)分(x±s)

2.2 骨痂VEGF免疫組織化學(xué)檢測(cè) 各標(biāo)本內(nèi)均檢測(cè)到VEGF陽性表達(dá)。①VEGF在生理鹽水組中陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，骨祖細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量少，骨祖細(xì)胞出現(xiàn)晚，未見骨小梁出現(xiàn)。②VEGF在三七對(duì)照組中陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨祖細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量較多，骨祖細(xì)胞出現(xiàn)較早，可見骨小梁出現(xiàn)，并見骨小梁周圍有血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨細(xì)胞。③VEGF在接骨湯組中陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量多，骨小梁較早出現(xiàn)，并見骨小梁排列致密，骨小梁周圍有大量血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組骨病VEGF的免疫組化檢測(cè)(×400)

2.3 九仙羅漢接骨湯對(duì)VEGF表達(dá)的影響 接骨湯組與三七對(duì)照組中VEGF的MOD在骨折愈合21d時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);提示接骨湯組與三七對(duì)照組在治療第14 d時(shí)促進(jìn)VEGF的合成和分泌高于生理鹽水組(P＜0.05)，兩組中的VEGF的MOD升高貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，并有促進(jìn)骨細(xì)胞成熟，加速骨折愈合的過程，見表2。

表2 各組各時(shí)點(diǎn)VEGF平均光密度值(x±s，n=10)

3 討論

骨折愈合是指骨折端之間再連接的修復(fù)過程可以重新形成與原骨的外形、結(jié)構(gòu)及其功能一樣的新骨〔5〕。骨再生是骨修復(fù)過程中的重要環(huán)節(jié)，任何形成的骨再生過程必須依賴于充足的血液供應(yīng)〔6〕。

VEGF最重要的生物學(xué)活性就是特異地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促其增殖和生長血管〔7〕。研究證實(shí)VEGF在骨形成和代謝中的作用主要是通過促血管生成參與骨發(fā)育形式〔8，9〕，VEGF可特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，最強(qiáng)的促血管生成因子〔10〕。促進(jìn)其增殖和血管生成，決定血管形成的量與時(shí)間，并可增加血管通透性〔11〕。VEGF在骨折愈合初始期表達(dá)較弱，主要在骨細(xì)胞內(nèi);在血管生成和軟骨形成期、軟骨鈣化期及軟骨消散期，隨著骨折的修復(fù)，肉芽組織長入血腫，軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞侵入發(fā)生軟骨內(nèi)骨化及膜內(nèi)骨化，在這一階段，組織修復(fù)耗氧，骨折局部低氧張力強(qiáng)烈誘導(dǎo)VEGF表達(dá)〔7〕。外源性VEGF作用下，局部血管形成增多，血流豐富，帶來了大量促進(jìn)骨折愈合的生物因子，促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖，使骨折斷端血循環(huán)重建及成骨過程加快，從而加快了成骨速度，縮短骨折愈合時(shí)間。創(chuàng)傷骨折后折端VEGF表達(dá)貫穿于骨折愈合的全過程，骨折愈合的不同階段，骨痂組織內(nèi)出現(xiàn)程度不同的VEGF高表達(dá)，其表達(dá)規(guī)律與骨折端血管再生重建呈正相關(guān)〔12～14〕。

任何骨折靠其自身的機(jī)體免疫反應(yīng)都會(huì)有自然愈合的傾向，但影響骨折愈合的因素眾多〔15，16〕，適宜的藥物干預(yù)能大大縮短骨折的愈合進(jìn)程〔17〕。九仙羅漢接骨湯對(duì)骨折的愈合有良好的促進(jìn)作用，促進(jìn)骨痂生長，縮短骨折愈合時(shí)間。

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