一種適于絲狀真菌基因RNA干擾方法的研究

張振穎 侯彬彬 劉霞

(1.香港大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳518053;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科，大連116023)

RNA干擾(RNAi)是真核生物中相對保守的基因沉默機(jī)制，它通過內(nèi)源或外源雙鏈RNA介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解或翻譯的抑制，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，并產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失［1］。1992年，Macino首次在粗糙脈胞菌中發(fā)現(xiàn)真菌中存在RNAi的現(xiàn)象后，RNAi技術(shù)漸成為一種對真菌進(jìn)行遺傳改造的新手段［2-4］。在絲狀真菌中RNAi技術(shù)具有特殊的優(yōu)勢:不受絲狀真菌的多核現(xiàn)象、異核現(xiàn)象和非同源重組頻率高的干擾，特別是當(dāng)需要使多個基因的表達(dá)同時下調(diào)時，使用RNA干擾比基因敲除更加方便。然而，真正將RNAi技術(shù)用在絲狀真菌的各項(xiàng)研究時還存在很多問題:真菌細(xì)胞多為多倍體，細(xì)胞壁含有較多的多糖及多糖蛋白等成分，使得RNA沉默的效果并不如在原生、動物細(xì)胞中理想，存在干擾效率低下、有脫靶效應(yīng)等缺陷。因此選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳轉(zhuǎn)化方法并制備合適的轉(zhuǎn)染載體，可以更高效地導(dǎo)入siRNA，保證導(dǎo)入siRNA的穩(wěn)定性，有效延長RNAi的作用時間，進(jìn)而大大提高靶基因抑制效率，更好地對絲狀真菌進(jìn)行基因改造。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 DH5α，申克孢子絲菌ATCC10268。

質(zhì)粒 pBI121，pBlueScriptII，pSilent-1(the Fungal Genetics Stock Center)。

酶和主要試劑 XbaI、XhoI、SpeI、SacI、KpnI、BglII、HindIII等限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq酶、T載體。DNA分子量Marker(Marker III)、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒。

培養(yǎng)基 ①LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(g/L)。②LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基 (g/L)。③誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM):在蒸餾水中溶解15 g瓊脂至900.7 mL，高壓后加入 0.8 mL K-buffer，20 mL MN-buffer，1 mL 1%CaCl2·2H2O，10 mL 0.01%FeSO4，5 mL 微量元素，2.5 mL 20%NH4NO3，10 mL 50%甘油，40 mL pH5.5 的 1 mmol/L MES，10 mL 的 20%葡萄糖。④篩選培養(yǎng)基 (SM):IM培養(yǎng)基中加入100μg/mL潮霉素，0.2 mol/L頭孢噻肟鈉。

1.2 重組載體PCB309-pfgrt的構(gòu)建

感受態(tài)細(xì)胞的制備 將DH5α菌保接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)16 h。然后轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基，220 r/min，37℃培養(yǎng)到OD600 0.6。將培養(yǎng)物冰上預(yù)冷 10 min，4℃，4 000 r/min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷30 mL的CaC12(0.1 mol/L)重懸，冰上放置 30 min，4℃，4 000 r/min離心 5 min，棄上清。最后用 1 mL預(yù)冷的CaC12(0.1 mol/L)重懸，用槍吹吸，使其均勻，按100 μL/管分裝。

轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 每管感受態(tài)細(xì)胞加入連接產(chǎn)物10μL，輕混勻，冰上放置30 min，42℃的水浴中，熱激70 s?？焖俎D(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻2 min。每管加入900μL的液體LB，37℃搖床溫育60 min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記抗性基因。4 000 r/min離心后用100μL液體LB重懸，涂布于含有相應(yīng)抗生素的固體LB平板上。倒置于37℃培養(yǎng)，16 h后挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證。

PCB309的構(gòu)建 ①構(gòu)建PCB298:以pBI121為模板，用引物PCB298-F和PCB298-R擴(kuò)增RK2復(fù)制區(qū)和 nptⅡ，長 4 566 bp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃45 s，72℃ 4 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min)。PCR 片段純化回收，用XbaI單酶切，酶切后再純化回收。酶切后的純化片段進(jìn)行連接，將單片段連接為環(huán)形質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，XbaI單酶切驗(yàn)證。②構(gòu)建PCB299:以PCB298為模板，用引物PCB299-F和PCB299-R擴(kuò)增RK2復(fù)制區(qū)和nptⅡ去除is1非必須區(qū)，得到片段長度 3 166 bp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)72℃ 10 min)。將PCR片段純化回收，用XhoI單酶切，酶切后再純化回收。酶切后的純化片段進(jìn)行連接，將單片段連接為環(huán)形質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，用XhoI酶切驗(yàn)證。③構(gòu)建PCB300:以pBI121為模板，用引物PCB300-F和PCB300-R擴(kuò)增pBI121的T-DNA全部區(qū)域，得到片段長度6 373 bp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 6 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min)。將PCR片段純化回收，用SpeI單酶切;將PCB299用XbaI單酶切。酶切后再分別純化回收。酶切后的純化PCR片段與PCB299進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，用引物PCB298-F和PCB298-R鑒定。④構(gòu)建PCB301:以PCB300為模板，用引物PCB301-F和PCB301-R擴(kuò)增T-DNA邊界序列和PCB300的序列，得到片段長度3 400 bp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 3 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min)。將PCR片段純化回收，用Sac I和KpnI雙酶切;將pBlueScriptII用Sac I和KpnI雙酶切。酶切后再分別純化回收。酶切后的純化PCR片段與pBlueScriptII切下來的多克隆位點(diǎn)(MCS)進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PCB301。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證。⑤構(gòu)建PCB309:以pSilent-1質(zhì)粒為模板，用引物HPH-F和HPH-R擴(kuò)增Ptrpc啟動子、潮霉素抗性基因和Ttrpc終止子的序列，得到片段長度約1.8 kp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min)。將PCR片段純化回收，用KpnI和HindIII雙酶切;將PCB301用KpnI和HindIII雙酶切。酶切后再分別純化回收。將酶切后的純化PCR片段與酶切后純化的PCB301載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PCB309。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，KpnI和HindIII雙酶切驗(yàn)證。

RNA干擾載體PCB309-pfgrt的構(gòu)建 ①構(gòu)建PUC-pgt:以pSilent-1質(zhì)粒為模板，用引物PUT-F和PUT-R擴(kuò)增Ptrpc啟動子、間隔序列和Ttrpc終止子的序列，得到片段長度約2.2 kp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 3 min，30 個循環(huán)，72℃10 min)。將純化后的PCR片段與Simple T載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-PUT。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，用引物PUT-F和PUT-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。②構(gòu)建PUC-pfgrt:擴(kuò)增靶基因正向干擾序列，純化回收產(chǎn)物經(jīng)酶切后與PUC-pgt載體連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-pfgt;擴(kuò)增靶基因反向干擾序列，純化回收產(chǎn)物經(jīng)酶切后與PUC-pfgt載體連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-pfgrt。③實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。④構(gòu)建PCB309-pfgrt:將PUC-pfgrt和 PCB309分別用 SpeI和SacI雙酶切。酶切后再分別純化回收 (37℃，3 h)。再進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PCB309-pfgrt(22℃，2 h)。⑤將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，SpeI和SacI雙酶切酶切驗(yàn)證。

表1 文中所用引物序列列表Tab.1 Primers sequences used in this experiment

根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ①由冰箱保存的菌種EHA105劃板以備挑單菌落SOB或LB固體平板，不加抗生素，常規(guī)3～4區(qū)劃板。②接種感受態(tài)細(xì)胞:挑一個單菌落1～2 mL SOB液體培養(yǎng)基中(利福平50μg/mL)。③將接菌后的試管于28℃，300 r/min，培養(yǎng) 6 h，導(dǎo)入 20 mL SOB 液體培養(yǎng)基中，300 r/min，37℃培養(yǎng)到 3 h時，測 1次OD600。④之后每10 min測1次，當(dāng)OD值接近0.76時，每2 min測1次，至 OD=0.76時，將菌液置冰水浴中，不斷搖動，隨后在50 mL離心管(預(yù)冷)中離心，4℃，2 000 g，10 min，棄上清。用預(yù)冷的滅菌重蒸水洗，離心2 200 g，10 min，棄上清。⑤再用預(yù)冷的10%甘油(V/V)以同樣方法洗兩次，離心2 400 g，10 min，最后1 次倒盡甘油，分裝，用-80℃的乙醇迅速冰凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)粒PCB309-pfgrt轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆驗(yàn)證 ①將質(zhì)粒采用電擊的方法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，冰上操作，取待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒PCB309-pfgrt和PCB309各1μL混入感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。②吸取置于已經(jīng)預(yù)冷的電擊杯中，擦去電擊杯外的冷凝水和蒸汽，推入電擊儀中，電壓為1.8 V，在電擊杯中加入1 mL LB培養(yǎng)基，沖洗，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞與培養(yǎng)基充分混合，吸取入試管中，28℃，1 h。③將培養(yǎng)好的菌液加入EP管中離心，棄上清，用剩余的液體重懸菌體，全部涂到含有抗生素Kan的LB培養(yǎng)基中 (Kan 50 mg/mL，利福平25 mg/mL)。④培養(yǎng)2 d后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證。用引物HPH-F和HPH-R擴(kuò)增Ptrpc啟動子、潮霉素抗性基因和Ttrpc終止子的序列，得到片段長度約 1.8 kp(94℃ 1 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min)。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組載體PCB309-pfgrt對孢子絲菌DRK1基因進(jìn)行干擾 ①確定孢子絲菌對潮霉素的敏感性:將孢子絲菌分生孢子 (1.0×104個/mL，涂100μL)接種于含有不同濃度潮霉素的沙氏培養(yǎng)基上 (25℃，5 d)，確定最佳使用濃度為100μg/mL。②a.分生孢子的制備:將分生孢子接種于沙氏培養(yǎng)基，25℃，5 d;b.在已產(chǎn)孢的沙氏培養(yǎng)基，加入1 mL水，輕輕震蕩，收集分生孢子;c.使用血細(xì)胞計數(shù)板確定孢子濃度，達(dá)到最終濃度為5.0×106個/mL。③農(nóng)桿菌細(xì)胞的制備:a.將農(nóng)桿菌菌保接種于含有20μg/mL Rif和100μg/mL Kan的LB 液基中，28℃ 24 h，200 r/min;b.將上述培養(yǎng)農(nóng)桿菌細(xì)胞收集于1.5 mL離心管，室溫，2 400 g離心10 min，棄上清;c.用IM液體重懸細(xì)胞，室溫，2 400 g離心10 min，棄上清;d.在100 mL錐形瓶中，將農(nóng)桿菌細(xì)胞重懸于15 mL添加200μmol/L AS的IM培養(yǎng)基，28℃ 8 h，100 r/min;e.當(dāng) OD 600 nm 為 0～0.8時，用于轉(zhuǎn)化。④農(nóng)桿菌與孢子絲菌共培養(yǎng):a.取1 mL OD 600 nm 為 0.6～0.8 的農(nóng)桿菌細(xì)胞與1mL濃度為5.0×106個/mL孢子絲菌分生孢子混合;b.將上述200μL混合液均勻涂布于1 M+200 μmol/AS和IM-AS的平板上，25℃避光培養(yǎng)。篩選轉(zhuǎn)化子:將共培養(yǎng)混合物的轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)平板上 (含100μg/mL潮霉素、0.2 mol/L頭孢噻肟鈉)25℃ 4 h，直至菌落出現(xiàn);將具有潮霉素抗性的孢子絲菌單菌落轉(zhuǎn)接于沙氏培養(yǎng)基，4℃保存。⑤檢測轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性:隨機(jī)挑選不同批次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的20個轉(zhuǎn)化子，在無潮霉素的沙氏培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次后，轉(zhuǎn)移至含有100 mg/L潮霉素的SM平板上，觀察轉(zhuǎn)化子是否仍具有潮霉素抗性，檢測轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性。

1.3 干擾效率的檢測

應(yīng)用Real-Time PCR方法對申克孢子絲菌DRK1組氨酸激酶基因mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行分析;應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法，以1#樣品Total RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對管家基因(18S)和目的基因 (DRK1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;然后再分別對各樣品的管家基因和目的基因進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，通過管家基因的校正，對各樣品中目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)試劑及引物 ①TaKaRa RNAiso Plus Reagent。②PrimeScript RT reagent Kit with gDNA E-raser。③SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus);18S-F(5’-agcggagggatcattacagag-3’);18S-R(5’-cgccagaagcaacgagaa-3’);DRK1-F(5’-CGATGAGTACGCGATTGAGTTT-3’);DRK1-R(5’-CGCTTGGAAATGGAAAGACC-3’)。

實(shí)驗(yàn)步驟 ①總RNA質(zhì)量的確認(rèn)，OD值測量。②Real Time PCR法檢測目的基因相對表達(dá)量。

反應(yīng)組成及反應(yīng)條件 ①基因組DNA去除反應(yīng) (5×gDNA Eraser Buffer 2μL;gDNA Eraser 1μL;Total RNA;1μL;RNase Free dH2O 6μL;42℃ 2 min)。②RT反應(yīng) (上述反應(yīng)液10μL;5×Primer-Script Buffer 2(for Real Time)4μL;PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL;RT Primer mix 1μL;RNase Free dH2O 4μL;37℃ 15 min 85℃ 5 s)。③PCR反應(yīng)(SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL;Primer F(10 μmol/L)1 μL;Primer R(10 μmol/L)1 μL;RT產(chǎn)物2μL;dH2O 8.5μL;95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40Cycles)。

2 結(jié) 果

2.1 干擾載體構(gòu)建過程中涉及到的酶切及PCR鑒定圖 (見圖1～2)

2.2 應(yīng)用Real-Time PCR方法進(jìn)行申克孢子絲菌組氨酸激酶DRK1基因相對表達(dá)量分析

我們利用Real-Time PCR方法對申克孢子絲菌組氨酸激酶DRK1基因相對表達(dá)量分析，從結(jié)果可見干擾后組氨酸激酶DRK1基因表達(dá)水平發(fā)生變化，以37℃野生標(biāo)準(zhǔn)株DRK1相對表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)1，干擾后37℃干擾株DRK1相對表達(dá)量為0.11;25℃野生標(biāo)準(zhǔn)株DRK1相對表達(dá)量為0.41，干擾后25℃干擾株DRK1相對表達(dá)量為0.12。與菌絲相相比較，酵母相DRK1的表達(dá)水平明顯升高，干擾后組氨酸激酶DRK1基因表達(dá)明顯降低(見圖3)。

3 討 論

目前存在的遺傳轉(zhuǎn)化方法眾多:CaCl2/聚乙二醇法，醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，粒子轟擊法和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。與其他方法相比，在絲狀真菌的研究中根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有如下優(yōu)勢:①不需制備原生質(zhì)體，各種類型的完整細(xì)胞 (如分生孢子、菌絲體、子實(shí)體)均可作為轉(zhuǎn)化受體。②產(chǎn)生的突變子大多數(shù)為單拷貝插入，其標(biāo)簽基因的分離更容易。③插入隨機(jī)性更好，亦能用于同源重組。由此可見，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法不失為真菌遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的一種重要手段，而構(gòu)建適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的、能夠轉(zhuǎn)染絲狀真菌的干擾載體尤為必要［5-10］。常用的植物雙元表達(dá)載體都比較大，多數(shù)在10 kb以上。做載體構(gòu)建時操作困難，轉(zhuǎn)化效率低，而且可用的單一酶切位點(diǎn)很少。本研究對現(xiàn)有的植物雙元表達(dá)載體進(jìn)行改造，而改造后的載體只有3.5 Kb，并加入了多克隆位點(diǎn)，從而適于真菌基因的干擾沉默研究中。另外，目前文獻(xiàn)報道干擾載體的適用范圍多較局限，為種屬特異性，僅適于皮膚癬菌屬/青霉菌屬/曲霉菌屬，大大限制了其應(yīng)用范圍。我們將改造后的載體加入了真菌通用啟動子Ptrpc、間隔序列和終止子Ttrpc，并引入了潮霉素抗性基因，使其在間隔序列兩側(cè)加上目的基因的正反向干擾序列后即可廣泛用在多種真菌基因干擾的研究中。現(xiàn)存的很多真菌基因干擾方法存在轉(zhuǎn)化效率低，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，本研究使用根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化體系，并對轉(zhuǎn)化體系中誘導(dǎo)劑的種類和濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、根癌農(nóng)桿菌與受體菌濃度之比等條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提高了轉(zhuǎn)化效率，保證了導(dǎo)入siRNA的穩(wěn)定性，明顯提高了靶基因的抑制效率。

圖1 PCB298酶切鑒定圖，PCB299酶切鑒定圖，PCB300 PCR鑒定圖，PCB309酶切鑒定圖 圖2 PUC-PUT PCR鑒定圖，PUC-Pfgt PCR鑒定圖，PUC-pfgrt酶切鑒定圖，PCB309-pfgrtT酶切鑒定圖 圖3 干擾前后孢子絲菌菌株的DRK1mRNA表達(dá)水平的變化。依次為:37℃野生標(biāo)準(zhǔn)株;37℃干擾株;25℃野生標(biāo)準(zhǔn)株;25℃干擾株Fig.1 PCB298 restriction map，PCB299 restriction map，PCB300 PCR product，PCB309 restriction map Fig.2 PUC-PUT PCR product，PUC-Pfgt PCR product，PUC-Pfgrt restriction map，PCB309-Pfgrt restriction map Fig.3 mRNA expression levels of DRK1 in Sprothrix schenckii before and after interference:wild type strain at 37℃，interference strain at 37℃，wild type strain at 25℃，interference strain at 25℃

本研究提供了一種由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的適于絲狀真菌基因研究用的RNA干擾方法，具體如下:干擾載體構(gòu)建，包括干擾載體的序列特征，目的基因正反相干擾序列替換的位置，載體構(gòu)建的具體條件;根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系中供體菌與受體菌濃度之比，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)劑種類和濃度等條件參數(shù)。我們應(yīng)用該體系實(shí)現(xiàn)了對孢子絲菌雙組份信號傳導(dǎo)通路中組氨酸蛋白激酶DRK1基因的有效修飾，明顯下調(diào)了該基因的表達(dá)水平，干擾后其表達(dá)水平僅為野生株11%。

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