骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)對(duì)脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細(xì)胞凋亡及膀胱纖維化影響的實(shí)驗(yàn)研究

宋 晨諸靖宇吳金星徐智慧張大宏

骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)對(duì)脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細(xì)胞凋亡及膀胱纖維化影響的實(shí)驗(yàn)研究

宋 晨1諸靖宇1吳金星1徐智慧2張大宏2

目的 觀察骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)對(duì)脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細(xì)胞凋亡及膀胱纖維化影響。方法 取雌性成年SD大鼠90只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組60只，空白對(duì)照組30只，采用脊髓橫斷法建立大鼠神經(jīng)源性膀胱的模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為電針組及陰性對(duì)照組，各30只。電針組進(jìn)行電極植入，并行電調(diào)節(jié)治療2周。3組大鼠2周后同時(shí)處死取材，均分別采用膠原染色、苦杏酸天狼星紅染色、免疫組化方法來(lái)觀察逼尿肌纖維化程度。采用透射電鏡觀察逼尿肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果①膠原染色及苦杏酸天狼星紅染色觀察，電針組同陰性對(duì)照組相比，平滑肌細(xì)胞之間膠原纖維的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列規(guī)則。②電針組膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)分別為（1.042± 0.213）、（1.532±0.141），均明顯低于陰性對(duì)照組的（2.049±0.246）、（3.901±0.208），電針組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較陰性對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組的（1.154±0.124）、（0.780±0.127），陰性對(duì)照組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較空白對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③電鏡觀察，電針組與陰性對(duì)照組相比，逼尿肌細(xì)胞表面平滑，排列均勻，胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)完整，無(wú)腫脹破裂現(xiàn)象，細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近于空白對(duì)照組。結(jié)論骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)能抑制脊髓損傷早期大鼠膀胱逼尿肌間質(zhì)中膠原纖維的表達(dá)，減少脊髓損傷后大鼠逼尿肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)膀胱功能恢復(fù)。

大鼠；脊髓損傷；骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)；逼尿肌細(xì)胞凋亡；膀胱纖維化

圖1 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度比較（膠原VG染色 ×400）注：a、b、c分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、電針組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞通過(guò)VG染色觀察到的纖維化程度

圖2 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度的比較（苦杏酸天狼星紅染色，×400）注：a、b、c分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、電針組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞通過(guò)苦杏酸天狼星紅染色觀察到的纖維化程度

圖3 各組大鼠膀胱組織中CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達(dá)（免疫組化染色，×400）注：a、b、c分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、電針組大鼠膀胱組織中CollagenⅠ的表達(dá)情況（陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，陰性對(duì)照組高表達(dá)）；d、e、f分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、電針組大鼠膀胱組織中CollagenⅢ的表達(dá)情況（陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，陰性對(duì)照組高表達(dá)）

圖4 各組大鼠膀胱逼尿肌電鏡下超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)（×24 000）注：a為空白對(duì)照組，b為陰性對(duì)照組，c為電針組

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重排尿障礙、上尿路損害以致腎功能衰竭的病因之一[1]。脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱早期階段因缺乏神經(jīng)刺激導(dǎo)致逼尿肌凋亡，逼尿肌中膠原纖維的增加導(dǎo)致膀胱順應(yīng)性下降[2]，繼而出現(xiàn)膀胱纖維化、儲(chǔ)尿及排尿功能障礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針關(guān)元穴可以緩解脊髓損傷后膀胱逼尿肌細(xì)胞凋亡[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)完全脊髓損傷大鼠模型，觀察電調(diào)節(jié)骶3神經(jīng)對(duì)大鼠膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)的改變及逼尿肌纖維化程度的影響，以期探討脊髓損傷后神經(jīng)源膀胱早期骶神經(jīng)電調(diào)節(jié)療效的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康成年雌性SD大鼠90只購(gòu)自上海斯萊克，合格證號(hào)：SCXK（滬）：2012-002。根據(jù)完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將90只大鼠隨機(jī)編號(hào)，取數(shù)，排序，分成實(shí)驗(yàn)組60只，空白對(duì)照組30只，采用脊髓橫斷法建立大鼠神經(jīng)源性膀胱的模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠中隨機(jī)分為電針組及陰性對(duì)照組。即進(jìn)入正式試驗(yàn)的大鼠樣本為每組30只。

1.2 動(dòng)物模型制作[4]腹腔注射戊巴比妥鈉（25～30mg/kg）麻醉大鼠，需要手術(shù)的兩組大鼠經(jīng)背部縱行切口，然后在脊髓T9節(jié)段行全橫斷術(shù)，并切除其上4mm脊髓組織，清除損傷腔內(nèi)殘留的神經(jīng)組織，在缺損腔內(nèi)植入骨臘作為填充物。逐層縫合切口。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：切除脊髓時(shí)尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙后肢拖地爬行。大鼠脊髓損傷后立即處于脊髓休克期，部分在恥骨聯(lián)合上緣可觸及脹大的膀胱。初期采用腹部按壓方式輔助排尿。

1.3 新型針式電極植入[5]及骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)方法 縫合皮膚即刻，電針組大鼠開始植入針式電極。平第3骶椎棘突，用帶電刺激穿刺針以75度角向內(nèi)斜刺20mm。術(shù)后前5天每天對(duì)造模成功大鼠按壓下腹部膀胱區(qū)輔助排尿3次，每只大鼠均單籠飼養(yǎng)。術(shù)后腹腔注射青霉素（每天50 000U/kg，連續(xù)3天）。將電針組大鼠用裝置固定，背部外露，將電極線連接穴位電針儀，予連接肌電刺激儀，用頻率3～5Hz的連續(xù)波，強(qiáng)度3～5V電刺激，以大鼠骶部和/或尾部顫動(dòng)而不致全身顫動(dòng)的表現(xiàn)為宜；每次電調(diào)節(jié)30min，每天1次，共2周。

1.4 取材時(shí)間及方法 待電針組電針治療2周后，同時(shí)處死3組大鼠，3組大鼠膀胱組織均分別應(yīng)用膠原（VG）染色、苦杏酸天狼星紅染色、免疫組化方法，觀察逼尿肌纖維化程度（膠原纖維含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例）；用透射電鏡觀察逼尿肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 膠原（VG）染色及苦杏酸天狼星紅染色觀察逼尿肌纖維化程度 厚度為4μm的切片予二甲苯脫蠟15min，梯度酒精復(fù)水，分別用VG染液及0.1%飽和苦味酸-天狼星紅溶液染色。

1.5.2 免疫組化法檢測(cè)大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達(dá) 陽(yáng)性反應(yīng)：細(xì)胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。染色結(jié)果采用半定量分析方法：評(píng)分以染色強(qiáng)度結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行乘積。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分：無(wú)明顯著色為0分，淡黃色或輕微黃色為1分，深黃或棕黃色為2分，棕褐色或黑褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比即每張免疫組化切片選擇5個(gè)不同的視野（× 400）觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)：≤5%評(píng)0分，6%～25%評(píng)1分，26%～50%評(píng)2分，51%～75%評(píng)3分，＞75%評(píng)4分。

1.5.3 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 取大鼠膀胱肌肉組織，標(biāo)本修剪成約1mm×1mm×1mm大小的膀胱逼尿肌組織塊，置于2.5%戊二醛溶液低溫固定，包埋、切片、鋨酸染色定位后超微切片（120nm），透射電鏡（× 24 000）觀察逼尿肌組織超微結(jié)構(gòu)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s） 表示，均為正態(tài)資料。組間整體分析為單因素方差分析，兩兩比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 大鼠造模后，共死亡5只，即有55只造模成功，確保了陰性對(duì)照組和電針組樣本量均大于25只。造模成功大鼠均存活良好，有明顯的后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，證實(shí)為成功的脊髓損傷模型。

2.2 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度比較

2.2.1 膠原VG染色觀察比較 空白對(duì)照組平滑肌細(xì)胞之間有膠原纖維和肌纖維存在，見(jiàn)圖1a（插頁(yè)）。陰性對(duì)照組平滑肌細(xì)胞之間膠原纖維較空白對(duì)照組大量增多，肌纖維明顯減少，見(jiàn)圖1b（插頁(yè)）。電針組平滑肌細(xì)胞之間的膠原纖維較陰性對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞排列較規(guī)則，見(jiàn)圖1c（插頁(yè)）。

2.2.2 苦杏酸天狼星紅染色觀察比較 空白對(duì)照組平滑肌細(xì)胞之間Ⅰ型膠原近似平行排列，密度均一；Ⅲ型膠原分布于Ⅰ型膠原周圍，見(jiàn)圖2a（插頁(yè)）。陰性對(duì)照組平滑肌細(xì)胞之間Ⅰ型膠原縱橫交錯(cuò)，排列紊亂，密度分布不均；Ⅲ型膠原比例較空白對(duì)照組增加，Ⅲ型膠原呈疏網(wǎng)狀散布于Ⅰ型膠原周圍，見(jiàn)圖2b（插頁(yè)）。電針組平滑肌細(xì)胞之間Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較陰性對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞排列規(guī)則，見(jiàn)圖2c（插頁(yè)）。

2.3 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá) 顯微鏡下觀察，CollagenⅠ和CollagenⅢ陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，每張免疫組化切片選擇5個(gè)不同的視野（×400）觀察，并判讀陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率。對(duì)每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘積評(píng)分，評(píng)分以陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度的乘積：0分為陰性（-），1～6分為弱陽(yáng)性，7～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)表1資料進(jìn)行整體分析（單因素分析），兩個(gè)指標(biāo)的3個(gè)組間整體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組（P均＜0.05），陰性對(duì)照組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較空白對(duì)照組和電針組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。電針組CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達(dá)及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1和圖3（插頁(yè)）。

表1 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)（±s）

表1 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達(dá)（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別陰性對(duì)照組空白對(duì)照組電針組只數(shù)26 30 29 F P CollagenⅠ表達(dá)2.049±0.246△1.154±0.124 1.042±0.213▲113.347＜0.05 CollagenⅢ表達(dá)3.901±0.208△0.780±0.127 1.532±0.141▲1,531.591＜0.05

2.4 各組大鼠膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)比較 電鏡觀察，空白對(duì)照組大鼠膀胱逼尿肌肌細(xì)胞分布均勻，走行整齊，細(xì)胞胞核形狀規(guī)則，胞漿內(nèi)少量線粒體出現(xiàn)輕微水腫現(xiàn)象，見(jiàn)圖4a（插頁(yè)）。陰性對(duì)照組較空白對(duì)照組逼尿肌細(xì)胞間間距變寬，外形、大小不一致，分布不均勻，排列走行紊亂，有大量凹陷，胞漿內(nèi)線粒體腫脹破裂呈空泡狀，見(jiàn)圖4b（插頁(yè)）。電針組較陰性對(duì)照組逼尿肌細(xì)胞表面平滑，排列均勻，胞漿內(nèi)有少量線粒體，且結(jié)構(gòu)較完整，部分腫脹破裂現(xiàn)象，細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近于空白對(duì)照組，見(jiàn)圖4c（插頁(yè)）。

3 討論

神經(jīng)源性膀胱的一個(gè)顯著病理特征是逼尿肌纖維化，即肌束間大量膠原纖維沉積，是導(dǎo)致膀胱順應(yīng)性下降，逼尿肌攣縮或收縮無(wú)力的主要原因[6]，因而出現(xiàn)膀胱貯存和排空障礙。逼尿肌萎縮與纖維化易導(dǎo)致膀胱高壓儲(chǔ)尿，進(jìn)而引起上尿路損害，導(dǎo)致腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此危害尤甚[7]。膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膀胱壁的膠原纖維主要為Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅲ型膠原是膀胱順應(yīng)性的決定因素，其含量增加將會(huì)導(dǎo)致膀胱壁彈性的喪失[8]和平滑肌功能的減退，從而導(dǎo)致膀胱攣縮、膀胱高壓。Deveaud等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在低順應(yīng)性膀胱組織中總的膠原含量?jī)H增加10%，而Ⅲ型膠原的含量卻增加49%。本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組大鼠膀胱逼尿肌中Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維含量均明顯增加，但Ⅲ型膠原纖維含量增高更為顯著（P＜0.05）。

脊髓損傷后功能恢復(fù)是臨床治療領(lǐng)域的難題之一；神經(jīng)系統(tǒng)損傷后難以恢復(fù)，并且影響神經(jīng)所支配的效應(yīng)器官，如膀胱逼尿肌、膀胱感覺(jué)等[10]。神經(jīng)電刺激和調(diào)節(jié)是神經(jīng)源性膀胱治療的新亮點(diǎn)，國(guó)內(nèi)有學(xué)者通過(guò)骶3神經(jīng)電針脊髓損傷患者來(lái)改善排尿、預(yù)防尿路感染等并發(fā)癥，取得明顯療效[11]。孫嵐等[12]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針調(diào)節(jié)對(duì)逼尿肌反射亢進(jìn)有平衡作用，可抑制逼尿肌的過(guò)度收縮，改善膀胱順應(yīng)性，并能改善膀胱組織的病理變化。電針調(diào)節(jié)既具有改善膀胱、尿道括約肌等骶神經(jīng)支配的效應(yīng)器官功能，也能促進(jìn)骶髓排尿中樞恢復(fù)[13]。

目前脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的后期治療尚未取得突破性進(jìn)展，有必要探索在脊髓損傷的早期階段進(jìn)行積極治療的可能性。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，電針調(diào)節(jié)明顯促進(jìn)脊髓損傷早期膀胱尿道功能恢復(fù)，抑制逼尿肌過(guò)度收縮，緩解尿道括約肌痙攣，能改善膀胱容量[5]。本實(shí)驗(yàn)采用骶3神經(jīng)通路對(duì)脊髓損傷早期膀胱進(jìn)行弱電刺激，結(jié)果提示電針組大鼠膀胱Ⅲ型膠原纖維含量顯著低于陰性對(duì)照組；透射電鏡發(fā)現(xiàn)電針組逼尿肌細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體破裂程度輕微，超微結(jié)構(gòu)的病理狀態(tài)得到改善。

綜上所述，骶3神經(jīng)電調(diào)節(jié)可以減少脊髓損傷早期膀胱逼尿肌細(xì)胞凋亡，抑制逼尿肌纖維化進(jìn)程，促進(jìn)脊髓損傷后膀胱逼尿肌功能恢復(fù)，改善膀胱順應(yīng)性。對(duì)于神經(jīng)電調(diào)節(jié)是否促進(jìn)骶髓排尿中樞恢復(fù)，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。電調(diào)節(jié)骶3神經(jīng)對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱早期康復(fù)的機(jī)制研究具有積極意義。

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（收稿：2014-08-20 修回：2014-12-23）

Effect of Sacral Neuromodulation Via S3 Foramen on the Apotosis of Detrusor Cells and Fibrosis of theBladder in Spinal Injured Rats

SONG Chen1,ZHU Jingyu1,WU Jinxing1,XU Zhihui2,ZHANG Dahong2.1Department of Urology,the Third People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou (310009),China;2Department of Urology, Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate sacral nerve stimulation through S3 foramen for the treatment of detrusor cell apoptosis and neurogenic fibrosis of the bladder in rats with spinal cord injury（SCI）.M ethods Ninety SD female rats were randomly divided into experimental group（n＝30）,control group（n＝30）,blank group（n＝30）.SCI model was established by crosscutting spine.Rats in experimental group were implanted with electrical acupuncture poles and had neruomodulation for 2 weeks.Rats in 3 groups were all sacrificed at the end of nerve stimulation and immunohistochemistry,collagen staining and Sirius Red F3B（SR）staining and transmission electron microscope（TEM）were used to observe the apoptosis and fibrosis of the detrusor muscle.Results Collagen and SR staining showed that less collagen fiber was seen between detrusor cells and the cells were more regular and smooth in experimental group than those in control group.Collagen I and collagen III were decreased in experimental group than those in control group（collagen I:1.042±0.213 vs 2.049±0.246,collagen III:1.532±0.141 vs 3.901±0.208,P＜0.05）.The ratio of collagen I to collagen III in experimental group was lower than that in control group with significant difference（P＜0.05）.The collagen I and collagen III of control group was higher than that of blank group（collagen I:1.154±0.124,collagen III:0.780±0.127,P＜0.05）and the ratio of collagen I to collagen III was also higher（P＜0.05）.TEM observed that the cells of experimental group were more regular and smoother than those ofcontrol group and no cell edema and destroied and the construction of the cells were similar to the normal cells（blank group）.Conclusion The S3 nerve electrical stimulation may improve bladder function by inhibiting apoptosis and fibrosis of detrusor cells in SCI rats.

rats;spinal cord injury;S3 neuromodulation;detrusor cell apoptosis;bladder fibrosis

杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.20110833B15）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011KYB070）

1杭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科（杭州 310009）；2浙江省人民醫(yī)院泌尿外科（杭州 310014）

徐智慧，Tel：13757179772；E-mail：jhtotal@163.com