基因m iRNA-34a靶向納米復(fù)合物抗前列腺癌細(xì)胞增殖的作用研究

于 淼，毛峻琴（解放軍85醫(yī)院藥劑科，上海 200052）

·論著·

基因m iRNA-34a靶向納米復(fù)合物抗前列腺癌細(xì)胞增殖的作用研究

于 淼，毛峻琴（解放軍85醫(yī)院藥劑科，上海 200052）

目的通過構(gòu)建具有前列腺癌細(xì)胞特異性靶向作用的基因載體適配體——聚乙二醇-聚酰胺-胺（APT-PEGPAMAM），攜帶具有抗前列腺癌增殖作用的基因m iRNA-34a，考察載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制作用。方法運(yùn)用核磁共振（NMR）鑒定APT-PEG-PAMAM基因載體的結(jié)構(gòu)；利用粒徑電位儀對(duì)APT-PEG-PAMAM／m i RNA納米復(fù)合物進(jìn)行表征；利用基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)考察APT-PEG-PAMAM／miRNA納米復(fù)合物在前列腺癌細(xì)胞（PC3和LNCaP）上的表達(dá)效果；利用CCK-8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)考察APT-PEG-PAMAM／m i RNA-34a對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果通過結(jié)構(gòu)鑒定確定APT-PEG-PAMAM合成成功。定性、定量轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)APT進(jìn)一步修飾后，對(duì)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率顯著增加，證明APT的靶向作用。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明，APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有抑制作用。結(jié)論APT-PEG-PAMAM／m i RNA-34a有望成為今后靶向治療前列腺癌的基因藥物。

微RNA；聚酰胺-胺；靶向治療；前列腺癌；基因載體

前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是指發(fā)生在前列腺的上皮惡性腫瘤。2012年我國(guó)腫瘤登記地區(qū)前列腺癌發(fā)病率為9.92／10萬，列男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位［1］。前列腺癌發(fā)病率在55歲前處于較低水平，55歲后逐漸升高，發(fā)病率隨著年齡的增加而上升，高峰年齡是70～80歲。家族遺傳型前列腺癌患者發(fā)病年齡稍早，年齡≤55歲的患者占43%［2］。對(duì)于早期前列腺癌患者可采用根治性治療方法，能夠治愈早期前列腺癌的方法包括：放射性粒子植入、根治性前列腺切除術(shù)、根治性外放射治療。對(duì)于中期前列腺癌患者應(yīng)采用綜合治療方法，如手術(shù)＋放療、內(nèi)分泌治療＋放療等。但這些治療方法存在不良反應(yīng)多、毒副作用大、患者依從性差等缺點(diǎn)。因此，針對(duì)前列腺癌中晚期基因藥物治療的研究是近年來的熱點(diǎn)之一［3］。

將目的基因靶向、可控并有效表達(dá)，是基因治療成功的關(guān)鍵。前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）是一種前列腺癌表面特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物，可作為前列腺癌靶向給藥的潛在靶點(diǎn)［4］。寡核苷酸適配體（aptamer，APT，簡(jiǎn)稱適體）是一種具有特定三維立體結(jié)構(gòu)的雙鏈或單鏈寡核苷酸，具有體外穩(wěn)定、易于合成等特點(diǎn)。適體A10-3.2是人工合成的第二代寡核苷酸適配體，可與前列腺癌細(xì)胞膜表面PSMA結(jié)合，以介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)向前列腺癌組織富集，實(shí)現(xiàn)靶向遞送作用［5］。另外，陽(yáng)離子聚合物聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）是一類帶有正電荷的樹枝狀高分子化合物。PAMAM表面富含氨基，帶正電荷，可與帶有負(fù)電荷的核苷酸通過靜電作用結(jié)合。同時(shí)，在前列腺癌，特別是p53突變的前列腺癌中，miRNA-34a表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致CD44高表達(dá)。抑制miRNA-34a可抑制前列腺癌干細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移，提示m iRNA-34a在前列腺癌治療中具有很好的應(yīng)用前景［6］。

因此，本研究利用APT-PEG-PAMAM包裹具有抑制前列腺癌增殖作用的基因m iRNA-34a，構(gòu)建前列腺癌納米靶向給藥系統(tǒng)，考察靶向給藥系統(tǒng)的體外靶向性及對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Mer cury Plus 300MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司）；IX2-RFACA倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N2（美國(guó)Clontech公司）；熒光素酶質(zhì)粒pGL3-Control Vector，細(xì)胞裂解液和熒光素酶分析系統(tǒng)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Promega公司）；QIAGEN Plasmid Mega Kit（德國(guó)Qiagen GmbH）；第五代PAMAM甲醇溶液（5%，體積分?jǐn)?shù)），Sulfhydryl Addition Kit，BCA Protein Assay kit（美國(guó)Thermo公司）；MAL-PEG-NHS，分子量3500（美國(guó)Nektar公司）；m iRNA-34a質(zhì)粒（上海英為信公司）；A10適配體（廣州銳博公司）；腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC3（PSMA－）和LNCaP（PSMA＋）方法參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.3 APT-PEG-PAMAM的合成 精密量取PAMAM甲醇溶液，氮?dú)獯蹈?，與雙活化的NHSPEG-MAL（PEG）溶液（溶于pH 8.0磷酸鹽緩沖液PBS）按照摩爾比PAMAM∶PEG＝1∶2混合，室溫避光反應(yīng)15min，產(chǎn)物采用超濾管（分子量10000截留）超濾純化，制得PEG-PAMAM。按照摩爾比PAMAM∶APT＝5∶1，定量取用DTT活化后的APT-SH溶液和PEG-PAMAM溶液，室溫避光反應(yīng)24h，制得APT-PEG-PAMAM［7］。

1.4 APT-PEG-PAMAM的結(jié)構(gòu)鑒定 分別稱量1mg的PAMAM、PEG-PAMAM和APT-PAMAM，溶于D2O，進(jìn)行核磁共振波譜分析。

1.5 APT-PAMAM／m i RNA-34a納米復(fù)合物的制備及粒徑Ze t a電位測(cè)定 APT-PAMAM與可表達(dá)miRNA-34a質(zhì)粒溶液（DNA）（12μg／m l）按照PAMAM與DNA的氮／磷（N／P）比1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1漩渦混合30s，即制得APT-PEG-PAMAM／miRNA復(fù)合物。不同N／P比APT-PEG-PAMAM／miRNA復(fù)合物粒徑和Zeta電位通過激光粒度測(cè)定儀Z90（英國(guó)Malvern公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.6 定性考察 APT-PEG-PAMAM的轉(zhuǎn)染效率pEGFP-N2綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC3（PSMA－）和LNCaP（PSMA＋）方法參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行?；虮磉_(dá)產(chǎn)物的綠色熒光利用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 定量考察 APT-PEG-PAMAM的轉(zhuǎn)染效率pGL3蟲熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC3（PSMA－）和LNCaP（PSMA＋）方法參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.8 m i RNA-34a納米復(fù)合物抗前列腺癌細(xì)胞增殖效果考察 前列腺癌細(xì)胞LNCa P同“1.2”項(xiàng)培養(yǎng)，將新鮮配制的3種納米復(fù)合物PEG-PAMAM／miRNA，APT-PEG-PAMAM／NC-m iRNA（negative control-miRNA），APT-PEG-PAMAM／miRNA（miRNA；m iRNA-34a）按照以下濃度稀釋備用：10、50、100、150、200、300、400、600、800、1000nmol／L。CCK-8法測(cè)定IC50曲線方法參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用軟件SPSS 18進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 APT-PEG-PAMAM結(jié)構(gòu)鑒定 本研究選用的雙功能PEG，兩端分別帶有馬來酰亞胺（MAL）和琥珀酰亞胺（NHS）基團(tuán)，其中NHS可與PAMAM表面氨基（-NH2）特異連接，得到PEG修飾的PAMAM。經(jīng)巰基（-SH）修飾的APT，可與PEG另一端MAL特異反應(yīng)而連接到PAMAM上。經(jīng)核磁共振（NMR）分析鑒定，4.7ppm左右為D2O溶劑峰，2.2～3.4ppm處是PAMAM骨架峰（圖1A）；3.6ppm左右為PEG中亞甲基特征吸收峰，6.7ppm處為MAL的特征峰（圖1B），從峰面積比可以得出，PEG∶PAMAM為2.7，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。在圖1C中，2.2～3.4ppm處是PAMAM骨架峰和APT中各氨基氫峰的重疊峰，6.7ppm處MAL的特征峰消失，說明MAL已與-SH反應(yīng)，證明合成了APT-PEG-PAMAM。

圖 1 核磁共振波譜圖A.PAMAM；B.PEG-PAMAM；C.APT-PEG-PAMAM

圖 2 不同N／P比的APT-PEG-PAMAM／miRNA納米復(fù)合物粒徑

圖 3 不同N／P比的APT-PEG-PAMAM／m iRNA納米復(fù)合物Zeta電位

2.2 不同N／P比的APT-PEG-PAMAM／m i RNA納米復(fù)合物粒徑和Ze t a電位考察 APT-PEG-AMAM／miRNA復(fù)合物粒徑隨著N／P比的增大而降低（圖2），Zeta電位隨N／P比的增大而增加（圖3），說明隨著N／P比的增大，載體所帶電荷增加，使得納米復(fù)合物顆粒包裹更加緊密。

2.3 定性觀察和定量檢測(cè)APT-PEG-PAMAM的轉(zhuǎn)染效率 熒光顯微鏡（圖4）和生物發(fā)光檢測(cè)儀（圖5）的檢測(cè)結(jié)果均顯示，隨著N／P比的增加，報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率增加。在相同濃度下，PEG-PAMAM經(jīng)APT修飾后，LNCaP（PSMA＋）轉(zhuǎn)染效率顯著增加，但PC3（PSMA－）細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率反而有所下降，表明經(jīng)APT修飾，能提高基因在PSMA陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率（圖5）。

圖 4 不同納米復(fù)合物在前列腺癌細(xì)胞PC-3和LNCa P中的p EGFP-N 2蛋白表達(dá)效果

圖 5 不同納米復(fù)合物在前列腺癌細(xì)胞PC-3和LNCa P中的p G l-3蛋白表達(dá)效果

2.4 mi RNA-34a納米復(fù)合物抗前列腺癌細(xì)胞增殖效果考察 3種納米復(fù)合物對(duì)LNCa P細(xì)胞作用結(jié)果經(jīng)GraPhpad 5.0軟件擬合后，得出3條細(xì)胞IC50曲線（圖6），與陰性對(duì)照組相比，2組納米復(fù)合物的IC50值都低于陰性對(duì)照組，說明miRNA-34a對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP具有抑制作用；PEG-PAMAM／m iRNA的IC50值高于APT-PEG-PAMAM／miRNA，說明APT的存在可以增加m iRNA-34a進(jìn)入細(xì)胞的總量，增強(qiáng)抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP增殖的效果。

圖 6 3種復(fù)合物抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP增殖效果考察（n＝3，ˉx±s）

3 討論

PAMAM是一類高度枝化、具有特定三維結(jié)構(gòu)、分子大小和構(gòu)型高度可控的樹枝狀大分子，其表面帶有正電荷，可以與基因形成納米復(fù)合物。PAMAM的分枝狀結(jié)構(gòu)特殊，隨著代數(shù)的增加，在4～6代的PAMAM中，出現(xiàn)了類似口袋的特殊結(jié)構(gòu)，它可以隨著pH值的變化而張開或關(guān)閉，由于細(xì)胞內(nèi)外pH值不同，PAMAM在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)形成質(zhì)子海綿效應(yīng)。近年來有研究利用PAMAM這一特性，將其作為化療藥物載體，利用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)外的pH值變化，實(shí)現(xiàn)化療藥物的緩釋［7］。本實(shí)驗(yàn)選用第五代PAMAM，利用具有雙功能活化的PEG修飾PAMAM，不僅能增加PAMAM分子結(jié)構(gòu)的柔性，同時(shí)可降低PAMAM的毒性，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)作用［9］。

具有PSMA靶向作用的適體A10是一種單鏈的RNA核苷酸，由于堿基之間存在錯(cuò)配，在體內(nèi)會(huì)形成特定的三維結(jié)構(gòu)，并與PSMA結(jié)合，從而發(fā)揮靶向作用。A10沒有明顯的免疫原性，其介導(dǎo)的靶向藥物注入人體內(nèi)不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用A10與PEG-PAMAM連接，構(gòu)建APTPEG-PAMAM基因靶向載體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的靶向作用。

根據(jù)NMR結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，APT-PEGPAMAM的合成是成功的。利用其包裹可表達(dá)miRNA-34a的質(zhì)粒，可形成帶有正電荷的納米復(fù)合物。利用定性及定量考察其對(duì)PC-3和LNCaP細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，PEG-PAMAM載體經(jīng)APT修飾后，PSMA高表達(dá)的LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率顯著增加，同時(shí)，PSMA低表達(dá)的PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率卻發(fā)生下降，結(jié)果提示APT對(duì)PAMAM修飾后，會(huì)對(duì)載體進(jìn)入細(xì)胞的途徑產(chǎn)生影響，導(dǎo)致載體轉(zhuǎn)染及入胞過程發(fā)生改變，對(duì)于PSMA陽(yáng)性LNCaP細(xì)胞，APT的存在有利于miRNA的表達(dá)，但對(duì)于PSMA陰性PC-3細(xì)胞，由于APT帶有負(fù)電荷，會(huì)降低PAMAM-PEG表面的正電荷，導(dǎo)致細(xì)胞非特異性吸附降低，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染效率降低。CCK-8抗LNCaP細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也證明，APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗增殖作用優(yōu)于PEGPAMAM／m iRNA-34a，可能是由于APT的存在，增加了miRNA-34a質(zhì)粒進(jìn)入LNCaP的數(shù)量，以及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效果，導(dǎo)致m iRNA-34a在細(xì)胞中的表達(dá)量增加，進(jìn)而增強(qiáng)了其抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖效果。

綜上所述，本研究為以適配體APT為靶頭，靶向具有PSMA表達(dá)前列腺癌細(xì)胞的聚陽(yáng)離子載體納米基因給藥系統(tǒng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床應(yīng)用miRNA-34a治療激素依賴型前列腺癌增殖提供了方法借鑒。

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Functional investigation of a new targeting gene delivery system of m iRNA-34a nano-complexes into prostate cancer cell lines

YU M iao，MAO Junqin（Department of Pharmacy，No.85Hospital of PLA，Shanghai200052，China）

ObjectiveTo construct a gene delivery carrier w ith aptamer-polyethylene glycol-dendrimer-polyamidoam ine（APT-PEG-PAMAM），form ing nanoparticles to specifically target prostate cancer cell lines，carrying prostate cancer cell proliferative suppressormicroRNA：miRNA-34a.We investigated the transfection efficiency of thisgene delivery system aswellas functionally studied its inhibitory effect on prostate cancer（PCa）cell proliferation.MethodsThe construction of APT-PEGPAMAM gene carrier was identified and confirmed by nuclear magnetic resonance（NMR）.The nano-complex sizes and zeta potential of APT-PEG-PAMAM gene carrier complexes weremeasured by zeta sizer.The efficiency of gene transfection of APT-PEG-PAMAM／miRNA nano-complexes were investigated by measuring the expression miRNA-34a in prostate cancer cells（PC3and LNCaP）；the PCa specific cell proliferation inhibition of APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a nano-complexes were investigated by measuring CCK-8cell proliferation inhibition experiments by comparing w ith APT-PEG-PAMAM and APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a nano-complexes.ResultsNMR resul ts demonst rated that APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a nano-complexes were successfully synthesized by structural identification.Qualitative and quantitative transfection efficiency experiments data show that the cellular uptake of vectors were concentration-dependent，after the APT furthermodified it significantly and increased the LNCaP cell transfection efficiency and specificity of PCa cells targeting ability.CCK8cell proliferation assay data indicated that APT-PEG-PAMAM／miRNA-34a has the anti-PCa cel ls effect.Conclusion APT-PEG-PAMAM／miRNA-34amay prove to see its efficacy for near future in pre-clinical and clinical study on the treatment of PCa.

microRNA；polyamidoamine；cancer targeting；prostatic cancer；gene vector

R737.2；Q78

A

1006-0111（2015）06-0539-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.016

2014-12-16

2015-04-23［本文編輯］李睿旻

于 淼，主管藥師.研究方向：納米靶向制劑.Tel：（021）81817040；E-mail：13661688861＠163.com

毛峻琴，主任藥師.研究方向：納米靶向制劑.Tel：（021）58172412；E-mail：mail：maojq204＠163.com