一例罕見的新的TCIRG1基因雜合性突變引起的嬰兒惡性石骨癥*

胡　彬，曾秉輝，胡悅林，趙　強(qiáng)，景象一，張永玲，王一鳴△(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，疾病基因組研究所，廣東廣州50080;廣州市婦女兒童醫(yī)療中心影像科，優(yōu)生圍產(chǎn)研究所，廣東廣州506)

一例罕見的新的TCIRG1基因雜合性突變引起的嬰兒惡性石骨癥*

胡彬1，2，曾秉輝1，2，胡悅林3，趙強(qiáng)1，2，景象一4，張永玲4，王一鳴1，2△
(中山大學(xué)1中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，2疾病基因組研究所，廣東廣州510080;廣州市婦女兒童醫(yī)療中心3影像科，4優(yōu)生圍產(chǎn)研究所，廣東廣州510623)

［摘要］目的:研究1例嬰兒惡性石骨癥患者的致病基因及其突變。TCIRG1和CLCN7是嬰兒惡性石骨癥最常見的致病基因。前者被認(rèn)為是純合性致病基因，國(guó)外只有6例其雜合性改變也致本病的報(bào)導(dǎo)，而我國(guó)無雜合性突變導(dǎo)致本病的報(bào)道。方法:通過骨組織X線檢查結(jié)合臨床癥狀及體征確診1例散發(fā)性嬰兒惡性石骨癥患者。提取患者及其父母的外周血基因組DNA，PCR擴(kuò)增TCIRG1和CLCN7基因外顯子及其剪切位點(diǎn)序列，對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。用TCRIG1基因附近的微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP構(gòu)建患者及其父母的單倍型。用染色體微陣列分析技術(shù)對(duì)患者及其母親進(jìn)行TCIRG1基因拷貝數(shù)目變異的檢測(cè)。結(jié)果:患者TCIRG1基因第5號(hào)外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)4個(gè)堿基的缺失突變c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)，該突變使得基因3’端編碼的666個(gè)氨基酸被截?cái)啵チ苏麄€(gè)ATP酶V0復(fù)合結(jié)構(gòu)域。患兒雙親TCIRG1和CLCN7基因的突變檢測(cè)及單倍體構(gòu)建證實(shí)該突變來源于患者父親。染色體微陣列分析未發(fā)現(xiàn)患兒及其母親攜帶有任何累及TCIRG1及CLCN7基因的拷貝數(shù)目變異。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了1例TCIRG1基因新的雜合性突變所致的嬰兒惡性石骨癥。這是我國(guó)TCIRG1基因雜合性突變引起嬰兒惡性石骨癥的首例報(bào)道。這個(gè)發(fā)現(xiàn)可用于嬰兒惡性石骨癥的分子診斷。

［關(guān)鍵詞］嬰兒惡性石骨癥; TCIRG1基因;缺失突變

嬰兒惡性石骨癥( infantile malignant osteopetrosis，IMO)是一種罕見的單基因遺傳性疾病，是石骨癥最嚴(yán)重的一種類型［1］。該病骨骼的異常表現(xiàn)為骨密度增高、病理性骨折、骨髓炎，其它臨床表現(xiàn)還有全血細(xì)胞減少、髓外造血、肝脾腫大、第II、VII、VIII對(duì)顱神經(jīng)受壓、腦積水、低鈣血癥等［2］。T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)子1( T-cell immune regulator 1，TCIRG1)和氯離子通道7( chloride channel 7，CLCN7)是最常見的致病基因［3-4］。TCIRG1基因編碼V型ATP酶116 kD同工型a3( V-ATPase 116 kD isoform a3)［5］，CLCN7基因編碼氯離子通道蛋白7( chloride channel protein 7，ClC-7)［6］。TCIRG1一般被認(rèn)為只在純合性突變或復(fù)合雜合性突變時(shí)致病，但國(guó)外有3個(gè)學(xué)者報(bào)道了6例其雜合性突變所致石骨癥［7-9］。而在我國(guó)還未存在類似文獻(xiàn)。本研究對(duì)1例石骨癥患者進(jìn)行TCIRG1基因突變篩查，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

1研究對(duì)象

本研究中的石骨癥病人來自于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。本研究得到了患者及其家屬的知情同意和中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

患者2歲時(shí)因摔傷到廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢查，確診為石骨癥。牙齒萌出障礙，至7歲時(shí)仍只萌出4顆牙齒。視力受損，眼底鏡檢查顯示視神經(jīng)萎縮。血常規(guī)顯示紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為3. 29×1012/L(正常范圍3. 79×1012～5. 88×1012/L)，血紅蛋白濃度為77 g/L(正常范圍110～147 g/L)。腹部B超顯示肝脾腫大。腦電圖無明顯異常。

頭部CT及X線片(圖1)顯示顱骨廣泛硬化、增厚，板障間隙消失。全身X線片顯示脊柱椎體上下緣致密增厚，中間較稀疏，呈“夾心餅”樣改變。盆骨骨髓腔消失，呈現(xiàn)“骨中骨”的特殊表現(xiàn)。所攝諸長(zhǎng)骨骨密度增高，骨髓腔消失，干骺端呈“燒瓶樣”改變。

2方法

2.1抽提基因組DNA取患者及其父母外周血3 mL，乙二胺四乙酸( ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，按天根血液基因組提取試劑盒操作指南提取DNA。

2.2引物設(shè)計(jì)和PCR從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)( http: / / genome.ucsc.edu)獲取TCIRG1和CLCN7基因序列，用Oligo 6. 0軟件分別設(shè)計(jì)10和16對(duì)引物，覆蓋所有編碼區(qū)域和剪切位點(diǎn)。這些引物由深圳華大基因研究院合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30 μL體系: 2× GCI緩沖液15 μL，2. 5 mmol/L dNTP混合物3 μL，LA Taq DNA聚合酶0. 3 μL，3. 2 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，滅菌水補(bǔ)足體積至30 μL。反應(yīng)條件: 95℃3 min; 95℃30 s，58℃45 s，72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán); 72℃10 min。

Figure 1.Radiological images of the patient.A，B: skull was generally sclerotic and the thickness increased; C，D: vertebral endplates was sclerotic and resulted in “sandwich vertebrae”appearance; E～G: the long bones showed the flask deformity and absence of bone marrow cavity; the bone marrow cavity of pelvis disappeared and showed“bone in bone”appearance.圖1　患者的影像學(xué)資料

2.3Sanger測(cè)序及突變鑒定在ABI 3730XL DNA測(cè)序儀上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Sequence Scanner分析，并與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)基因參考序列比對(duì)，突變命名采用標(biāo)準(zhǔn)命名法( http: / /www.hgvs.org/mutnomen/)，+ 1代表翻譯起始密碼子ATG中的A。對(duì)檢測(cè)到的突變，用PCR法擴(kuò)增父母相應(yīng)的外顯子，并用直接測(cè)序法測(cè)序分析。

2.4基因分型及單倍體構(gòu)建我們對(duì)患者及其父母TCIRG1基因附近的微衛(wèi)星標(biāo)記D11S987、D11S4162和D11S1314進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在ABI 3730XL DNA測(cè)序儀上進(jìn)行基因型鑒定。在TCIRG1基因內(nèi)及其附近選取雜合度較高的SNP rs4147780、rs12273861、rs2075609和rs11481設(shè)計(jì)4對(duì)引物行PCR擴(kuò)增，并用直接測(cè)序法鑒定其基因型。對(duì)rs7116924、rs3808974、rs10896289和rs11228127，則分別在第1、3、5和10對(duì)引物的測(cè)序結(jié)果中分析其基因型。根據(jù)所有基因型信息構(gòu)建單倍體。

2.5染色體微陣列分析我們用CytoScan 750K Array( Affymetrix)對(duì)患者及其母親進(jìn)行染色體微陣列分析。我們根據(jù)Affymetrix的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行了DNA提取、擴(kuò)增、片段化、標(biāo)記和雜交。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Chromosome Analysis Suite軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果

1 TCIRG1基因

患者TCIRG1基因直接測(cè)序結(jié)果顯示，第5個(gè)外顯子內(nèi)檢測(cè)到1個(gè)小的雜合缺失突變c.449 _ 452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)，見圖2。該突變使得開放閱讀框改變，在肽鏈第164位引入終止密碼子，使得3’端666個(gè)氨基酸被截?cái)?，失去了整個(gè)ATP 酶V0復(fù)合結(jié)構(gòu)域，見圖3。由于該結(jié)構(gòu)域是V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白實(shí)現(xiàn)氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此可以預(yù)測(cè)患者的突變使該蛋白完全失去功能。對(duì)患兒雙親的突變檢測(cè)及單倍體構(gòu)建結(jié)果表明該突變遺傳自患者父親，見圖4。

Figure 2.Partial reverse sequence of the patient ( lower) and his mother ( upper).The c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) mutation of the patient was showed in the box.圖2　患者和其母親的部分反向測(cè)序圖

Figure 3.Prediction of the effect of c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) mutation.The mutation was predicted to wipe out 666 amino acids from the V-ATPase 116 kD isoform a3 protein.SP: signal peptide motif; CC: coiled-coil motif.圖3　c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)突變效果預(yù)測(cè)

2 CLCN7基因

對(duì)CLCN7基因的篩查未發(fā)現(xiàn)致病性突變。

3染色體微陣列分析

染色體微陣列分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)患者及其母親累及TCIRG1及CLCN7基因的拷貝數(shù)目變異( CNV，copy number variation)。

討論

TCIRG1基因及CLCN7基因是最常見的嬰兒惡性型石骨癥的致病基因，前者被認(rèn)為是隱性基因。我們?cè)诨颊咧邪l(fā)現(xiàn)了TCIRG1基因的新的雜合性突變，而CLCN7基因未發(fā)現(xiàn)異常。這一新的TCIRG1基因突變c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)造成了氨基酸的移碼改變，并截?cái)嗔薞型ATP酶116 kD同工型a3蛋白，使其失去必不可少的ATP酶V0復(fù)合結(jié)構(gòu)域，因此是一個(gè)致病性突變。由于Sanger測(cè)序不能檢測(cè)拷貝數(shù)目變異［10-11］，因此我們對(duì)患者及其母親進(jìn)行染色體微陣列分析。染色體微陣列研究結(jié)果排除了累及本基因的拷貝數(shù)目變異。這表明，本基因的雜合性突變也可能引起本病，這種雜合性突變致病的報(bào)道國(guó)外已有［7-9］，但在國(guó)內(nèi)為首例。

Figure 4.Pedigree of the family and haplotype analysis.Black bars depicted the disease-causing haplotypes.圖4　家系圖和單倍型分析

本文作者曾報(bào)道一例嬰兒惡性型石骨癥［12］，該患者由TCIRG1基因c.242delC( p.Pro81ArgfsX85)突變和c.1114C＞T( p.Gln372X)突變引起。其中c.242delC( p.Pro81ArgfsX85)突變與本文報(bào)道的c.449 _452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)突變相似，也造成移碼突變，使V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白3’端666個(gè)氨基酸被截?cái)啵拐麄€(gè)ATP酶V0復(fù)合結(jié)構(gòu)域丟失。其不同之處主要在于，本文報(bào)道的c.449_ 452delAGAG突變出現(xiàn)在卷曲螺旋( coiled coil)之后，沒有破壞卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)，而c.242delC突變出現(xiàn)在卷曲螺旋之前，破壞了卷曲螺旋。雖然本文報(bào)道的突變c.449_452delAGAG未影響卷曲螺旋，但由于該突變已經(jīng)使整個(gè)ATP酶V0復(fù)合結(jié)構(gòu)域丟失，因此即使突變蛋白仍有表達(dá)，也無法行使正常功能。

TCIRG1基因編碼的V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白是破骨細(xì)胞吸收骨組織的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。V型ATP酶可以在消耗ATP的同時(shí)向分泌性溶酶體泵入氫離子，之后，分泌性溶酶體被轉(zhuǎn)運(yùn)到破骨細(xì)胞的骨組織面，與細(xì)胞膜融合，在破骨細(xì)胞和骨組織之間形成皺褶緣，并使皺褶緣和骨組織之間的液體酸化，促使骨組織被吸收［1］。當(dāng)TCIRG1基因的突變使a3蛋白失去功能時(shí)，V型ATP酶失去轉(zhuǎn)運(yùn)氫離子的功能，破骨細(xì)胞無法吸收骨組織。

破骨細(xì)胞吸收骨組織的功能喪失后，骨組織不能進(jìn)行改建，骨髓腔消失，骨密度增加。患者髓腔內(nèi)造血功能受到不同程度的破壞，可表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少，也可僅紅細(xì)胞減少。這促使髓外造血的發(fā)生，患者可表現(xiàn)為肝脾腫大。骨組織改建功能的喪失，也使得各出顱神經(jīng)孔狹窄，腦神經(jīng)受壓，患者可表現(xiàn)為視神經(jīng)損傷，聽力損傷。另外，由于牙齒的萌出需要相應(yīng)的牙槽骨及時(shí)被吸收，因此石骨癥患者往往還有牙齒不能萌出的表現(xiàn)［2］。本研究中患者表現(xiàn)為骨密度增加，紅細(xì)胞減少，肝脾腫大，視神經(jīng)受壓，牙齒萌出障礙，可見本研究中患者的臨床表現(xiàn)是非常典型的。

我們對(duì)患者雙親TCIRG1基因的檢測(cè)及單倍體分析提示患者父親也攜帶這一致病性突變，但其表型完全正常，這一結(jié)果提示，本基因是否還有外顯不全的可能?造成外顯不全現(xiàn)象的原因非常復(fù)雜，修飾基因、等位基因的隨機(jī)表達(dá)、表觀遺傳學(xué)的修飾以及環(huán)境因素、患者的年齡、性別等因素都可在一定程度上影響疾病的外顯率［13］。這些影響基因突變效果的因素，在石骨癥另外一個(gè)基因CLCN7中得到了充分體現(xiàn)。CLCN7基因的突變可引起嬰兒惡性型、中間型、成人型石骨癥［4］。其中，嬰兒惡性型和中間型是由純合或復(fù)合雜合性突變?cè)斐傻模扇诵褪怯呻s合性突變?cè)斐傻?，且成人型石骨癥存在外顯不全的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象使我們有理由推測(cè)，有某些修飾基因、表觀遺傳學(xué)修飾等因素，能使石骨癥的表型加重或減輕，甚至引起外顯不全的現(xiàn)象。因此，本研究中TCIRG1基因新突變c.449 _ 452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16)在家系中的外顯不全現(xiàn)象，也可能是通過這些機(jī)制產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究在1例嬰兒惡性型石骨癥患者TCIRG1基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雜合性突變，這是國(guó)內(nèi)第1例，國(guó)際上第7例由TCIRG1基因雜合性突變引起的石骨癥的報(bào)導(dǎo)。這為進(jìn)一步揭示嬰兒惡性型石骨癥的發(fā)病機(jī)制提供了新的數(shù)據(jù)。

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An unusual and novel heterozygous TCIRG1 mutation causes infantile malignant osteopetrosis

HU Bin1，2，ZENG Bing-hui1，2，HU Yue-lin3，ZHAO Qiang1，2，JING Xiang-yi4，ZHANG Yong-ling4，WANG Yi-ming1，2
(1Department of Medical Genetics，Zhongshan School of Medicine，2Institute of Disease Genomics，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;3Department of Radiology，4Department of Prenatal Diagnostic Center，Guangzhou Women and Children’s Medical Center，Guangzhou 510623，China.E-mail: ywzhong@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the underlying genetic changes of a Chinese patient with infantile malignant osteopetrosis ( IMO).IMO is a monogenic disease，mostly caused by mutations of TCIRG1 and CLCN7 genes.The former is believed a homozygous gene and only cause the disease in homozygous or compound heterozygous status.However，it has been reported that heterozygous mutations also cause the disease in 6 non-Chinese cases.METHODS: Genomic DNA was extracted from peripheral blood of the patient and his parents.All exons and splice sites of TCIRG1 and CLCN7 genes were amplified by PCR followed by Sanger sequencing.Mutation detection in the 2 genes was also investigated in the parents.Haplotypes were constructed by variations obtained in mutation detection and microsatillites flanking TCIRG1 gene in the family by Cyrillic.Chromosomal microarray analysis ( CMA) was performed to detect copy number variations ( CNV) of the patient and his mother.RESULTS: A novel mutation c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) was detected in the patient.This mutation truncated 666 amino acids at the C terminal of the V-ATPase 116 kD isoform a3 protein.It wiped out the entire ATPase V0 complex and was predicted to result in total loss of protein function.This mutation was also detected in the patient’s father.No pathogenic mutation was detected in CLCN7 gene.CMA did not reveal any CNV involving TCIRG1 or CLCN7 gene.CONCLUSION: We reported a novel heterozygous mutation of TCIRG1 gene causing IMO.This represents the first IMO case in China caused by heterozygous TCIRG1 gene mutation.

［KEY WORDS］Infantile malignant osteopetrosis; TCIRG1 gene; Deletion mutation

通訊作者△Tel: 020-87332055; E-mail: ywzhong@ hotmail.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.31471193)

［收稿日期］2015-01-12［修回日期］2015-02-27

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1237-05

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.015