Decorin對僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞增殖及I型膠原蛋白表達的影響*

邢幫榮，陳郁鮮，曾　花，楊曉燕，梁彩倩，周偉雄，孔慶磊，韓建華，張永標△(中山大學附屬第三醫(yī)院急診科，骨科，廣東廣州50630)

Decorin對僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞增殖及I型膠原蛋白表達的影響*

邢幫榮1，陳郁鮮2，曾花1，楊曉燕1，梁彩倩1，周偉雄1，孔慶磊1，韓建華1，張永標1△
(中山大學附屬第三醫(yī)院1急診科，2骨科，廣東廣州510630)

［摘要］目的:探討重組核心蛋白聚糖( decorin)對人僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的增殖和Ⅰ型前膠原蛋白( PcⅠ) mRNA表達及Ⅰ型膠原蛋白( ColⅠ)合成的影響，為decorin治療人膝關(guān)節(jié)僵直提供理論依據(jù)。方法:分離培養(yǎng)人僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞，分別加入不同濃度( 0.1、5和10 mg/L)的decorin;培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用MTT法測定關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的活力;用流式細胞術(shù)檢測滑膜B型細胞的周期和凋亡; RT-PCR法檢測滑膜B型細胞的PcⅠmRNA表達; Western blot檢測ColⅠ的合成。結(jié)果: 5和10 mg/L的decorin可有效降低滑膜B型細胞的活力( P＜0.05)，明顯增加處于G0/G1期細胞的百分比( P＜0.05)，并下調(diào)PcⅠmRNA的表達，抑制ColⅠ的合成;同時實驗組和對照組均未檢測到終末期凋亡細胞。結(jié)論: Decorin可抑制人僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的增殖、PcⅠmRNA的表達和ColⅠ的合成，在防治膝關(guān)節(jié)僵直中可能起一定的作用。

［關(guān)鍵詞］膝關(guān)節(jié)僵直;滑膜B型細胞;核心蛋白聚糖; I型膠原蛋白

研究表明膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞即關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞樣滑膜細胞( fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LC)的大量增殖、膠原蛋白等細胞外基質(zhì)的大量沉積是導致創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)僵直的重要病因之一［1］，而這些都與轉(zhuǎn)化生長因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)密切相關(guān)。核心蛋白聚糖( decorin)作為TGF-β的天然抑制因子，可調(diào)節(jié)細胞黏附、遷移、增殖和膠原纖維的形成，抑制纖維化粘連［2］。我們選擇創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)僵直的關(guān)節(jié)滑膜B型細胞作為研究對象，用不同濃度decorin作用于實驗組和對照組關(guān)節(jié)滑膜B型細胞。在細胞水平上探討TGF-β拮抗劑decorin在體外抑制創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)囊纖維瘢痕增生的作用及機制，為decorin治療創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)僵直提供理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑及儀器

Decorin( Sigma) ; DMEM干粉培養(yǎng)基和胰酶干粉劑( Gibco) ;小牛血清(杭州四季青) ;Ⅰ型膠原蛋白( collagen type I，Col I)抗體( Chemicon) ; RT試劑盒( MBI Fermentas) ; DRR034A PCR試劑盒和DL2000 DNA Marker( TaKaRa) ;Ⅰ型前膠原蛋白( procollagen typeⅠ，PcⅠ)的引物(上游引物5’-TCCAAAGGAGAGAGCGGTAA-3’，下游引物5’-GACCAGGGAGACCAAACTCA-3’，片段長度693 bp)和內(nèi)參照三磷酸甘油脫氫酶( glycerol-3-phosphate，GAPDH)的引物(上游引物5’-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3’，下游引物5’-CGGCCATCGCCACAGTTT-3’，片段長度300 bp)由上海博亞生物工程有限公司合成; TRIzol試劑盒( Gibco) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( TaKaRa) ; GeneGnome圖像分析系統(tǒng)( Gene) ; Western blot試劑盒( Promega)。

2實驗分組及關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的處理

實驗用滑膜B型細胞采用滑膜組織塊(取自中山大學附屬第三醫(yī)院骨科關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后標本，病人知情并同意捐獻)培養(yǎng)法，為第3～4代細胞;實驗共分為4組，對照組(只加DMEM)以及0.1 mg/L、5 mg/L和10 mg/L decorin組;將滑膜B型細胞以每孔2×103接種于6孔板中，待48 h細胞鋪滿板底80%時，改換成含10%胎牛血清的dMEM培養(yǎng)基。依次分別加入對應濃度的decorin。上述各組分別作用24 h、48 h、72 h后，終止培養(yǎng);收集各組細胞備用。

3MTT法測定細胞活力

將滑膜B型細胞用2.5 g/L胰酶消化脫壁，用含10%小牛血清的DMEM調(diào)整細胞密度為2×107/L，接種96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 h，倒置顯微鏡下觀察細胞單層鋪滿孔底的80%時，分別加入對應濃度的decorin，每個濃度的decorin組設(shè)6個復孔，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育24 h、48 h和72 h后，每孔加入0.5 %MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞中見藍紫色細針狀結(jié)晶形成。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，鏡下觀察見結(jié)晶完全溶解。同時設(shè)置調(diào)零組(只含培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照組(只含細胞、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處測量各孔的吸光度。

4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

收集第3代細胞，用含10%小牛血清的DMEM調(diào)整細胞密度為1×109/L，取1 mL細胞懸液接種于6孔板內(nèi)。置37℃、5 % CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入對應濃度的decorin，每組設(shè)立4個復孔。置37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后終止。用2.5 g/L的胰酶消化并離心( 800 r/min)收集細胞，PBS洗滌2次，棄上清，加入100 mg/L RNase A，37℃水浴并振蕩15 min以去除RNA，加入500 μL PBS含50 mg/L溴化乙錠( PI)，4℃避光孵育20 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，汞激發(fā)波長488 nm，計數(shù)8 000個細胞，結(jié)果用Lysis軟件分析細胞周期和細胞凋亡。

科室之間或者同事之間,可以直接溝通解決的問題,非要上報護士長甚至護理部來間接溝通,影響同事間的友誼,降低工作效率,影響工作氣氛。

5RT-PCR法檢測PcⅠmRNA的表達

5.1提取細胞總RNA分別取不同濃度的decorin作用后24 h、48 h和72 h的實驗組、對照組的細胞，各組每個時相點設(shè)3個復孔。以TRIzol法提取細胞總RNA(按試劑盒說明書進行)，－70℃保存。

5.2逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊進行操作。每個樣品取500 ng總RNA、Ⅰ型膠原蛋白和GAPDH的下游引物各0.5 μL，總體積10 μL逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;反應條件: 30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。

5.3PCR擴增PcⅠ和GAPDH的產(chǎn)物取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μL，PcⅠ和GAPDH的上、下游引物各0.5 μL，總體積50 μL進行PCR反應;反應條件: 94℃預變性2 min;然后94℃30s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物分裝，－20℃保存。

5.4電泳鑒定每個樣品取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混合上樣，以2%瓊脂糖凝膠，100 V電泳45 min，進行PCR產(chǎn)物鑒定，反射紫外燈下用GeneGnome圖像分析系統(tǒng)掃描分析，mRNA相對含量用其PCR產(chǎn)物與GAPDH吸光度×面積的比值表示。

6Western blot檢測ColⅠ的表達

6.1總蛋白制備不同濃度的decorin作用B型細胞24 h、48 h和72 h后，每個時點收集細胞，提取細胞蛋白，－70℃條件下保存，備齊標本。

6.2 Western blot檢測Ⅰ型膠原蛋白表達聚丙烯酰胺凝膠電泳采用40 g/L濃縮膠、120 g/L分離膠，上樣量60 μg，電壓80 V待蛋白跑出濃縮膠后調(diào)致180 V，電泳結(jié)束后取出凝膠，用夾心方法把濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、濾紙依順序放好，然后用海綿布、篩孔板固定好，插入電轉(zhuǎn)移槽中，并加入電轉(zhuǎn)移緩沖液，保證凝膠在陰極，硝酸纖維素薄膜在陽極方向。放入轉(zhuǎn)移槽中，100 V電壓下轉(zhuǎn)膜100 min，取出硝酸纖維素薄膜置入20g/L牛血清白蛋白/PBST液中37℃封閉2 h。加入Ⅰ型膠原的Ⅰ抗，4℃冰箱過夜。Ⅰ型膠原Ⅰ抗為鼠抗人Ⅰ型膠原抗體，稀釋度為1∶1 500;Ⅱ抗: EnVisionTMPeroxidase Rabbit，稀釋度為1∶2 000。次日漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次5 min，再加入適當稀釋的Ⅱ抗，室溫2 h，取出再次漂洗3次，每次5 min，用ECL發(fā)光液涂抹于硝酸纖維素薄膜上，反應5 min;吸干膜表面液體，用塑料保鮮膜包裹后固定于壓片匣中，曝光顯影。實驗組和對照組每個時相點均取3個蛋白樣本進行檢測。將X射線膠片置于圖像分析系統(tǒng)。測定目的條帶的平均吸光度值，并將3次實驗結(jié)果的平均值作為Ⅰ型膠原蛋白含量的相對值。

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 Decorin對僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞活力的影響

0.1mg/L decorin組與對照組比較，在各個時點的滑膜B型細胞活力雖然有降低，但差異無統(tǒng)計學意義; 5 mg/L組和10 mg/L decorin組在各時間點與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)，見表1。

表1　Decorin作用不同時間后對膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞活力的影響Table 1.The MTT values of FLC treated with decorin ( Mean± SD.n =6)

2 不同濃度decorin對僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞周期和凋亡的影響

在每個時點與對照組比較，0. 1 mg/L decorin組G0/G1期細胞比率增多不明顯，而5、10 mg/L組的G0/G1期細胞比率顯著增多( P＜0.05)，表明5、10 mg/L組靜止期細胞顯著增多;與對照組比較，0. 1 mg/L組G2/M + S期細胞比率無明顯改變，而5、10 mg/L組G2/M + S期細胞比率顯著減少( P＜0.05)。所有實驗組和對照組均未檢測到終末凋亡細胞，見表2。

3 RT-PCR法檢測PcⅠmRNA的表達

每個時點隨著decorin的濃度增加，PcⅠmRNA表達量明顯降低，5 mg/L和10 mg/L組的PcⅠmRNA表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義( P＜0. 05)，而0.1 mg/L組的PcⅠmRNA表達量與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖1。

表2　Decorin作用滑膜B型細胞后，細胞周期中各期細胞的比率Table 2.The flow cytometry results of FLC treated with decorin( %.Mean±SD.n =4)

4 Western blot檢測I型膠原蛋白的表達

每個時點隨著decorin濃度增高，條帶密度降低。5 mg/L和10 mg/L decorin組與對照組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達量的差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05) ; 0. 1 mg/L decorin組與對照組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達量的差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 1.RT－PCR results for Pc I mRNA expression in FLC.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control group.圖1　RT-PCR法檢測關(guān)節(jié)滑膜B型細胞Ⅰ型前膠原蛋白mRNA的表達

Figure 2.Western blot results of collagen type I ( Col I) protein expression in FLC treated with decorin for 24 h，48 h and 72 h.Mean ±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control group.圖2　不同濃度decorin作用關(guān)節(jié)滑膜B型細胞24 h、48 h和72 h后Ⅰ型膠原蛋白的表達

討論

損傷后膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的激活，滑膜B型細胞大量增殖與凋亡抑制以及I型膠原蛋白等細胞外基質(zhì)( extracellular matrix，ECM)的大量沉積是導致關(guān)節(jié)僵硬最重要的原因［3］，最終膝關(guān)節(jié)滑膜囊纖維瘢痕形成;雖然有許多細胞生長因子都參與了成纖維細胞的激活過程，以及瘢痕纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展，但已有研究表明TGF-β起到了關(guān)鍵的作用［4］;據(jù)此推測TGF-β的天然拮抗劑decorin可能抑制創(chuàng)傷后僵直膝關(guān)節(jié)囊纖維瘢痕的形成，相關(guān)研究國內(nèi)尚未見報道。本研究利用不同濃度decorin作用體外培養(yǎng)的僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞，從細胞和蛋白水平證實decorin能有效抑制僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的活力和Ⅰ型膠原蛋白的合成，因此推測其有可能抑制僵直膝關(guān)節(jié)囊纖維瘢痕的形成，為創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)僵直的治療提供了一個新的靶點和方法，并為進一步利用decorin治療創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)僵直提供了實驗基礎(chǔ)。

Decorin是一種小分子的硫酸軟骨素類蛋白多糖，廣泛分布于人和動物的皮膚、肌腱、骨、軟骨、韌帶等部位的結(jié)締組織中，具有抗纖維化及抑制細胞生長的兩大特性［5］。作為體內(nèi)自身正常的TGF-β調(diào)節(jié)因子，decorin能夠調(diào)節(jié)細胞黏附、遷移、增殖和I型膠原纖維的形成，起著生理狀態(tài)下的抑制纖維化粘連的作用［6］;研究表明一定劑量的decorin能抑制靶組織的纖維化［7］。本實驗通過MTT法測得不同濃度的decorin對人僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的活力有不同影響，在每個時點，低濃度的decorin( 0.1 mg/L)抑制關(guān)節(jié)滑膜B型細胞活力作用不明顯;而高濃度( 5 mg/L和10 mg/L)的decorin對關(guān)節(jié)滑膜B型細胞活力有明顯抑制作用，提示要使decorin發(fā)揮有效的抑制作用必須要達到一定的濃度。流式細胞術(shù)檢測各實驗組和對照組，均未檢測到凋亡的細胞，表明decorin對細胞無明顯毒性。同時流式細胞術(shù)的結(jié)果表明高濃度的( 5 mg/L和10 mg/L) decorin能明顯增加G0/G1期細胞的數(shù)量，降低細胞的增殖率［( G2/M + S) %］，而低濃度組作用不明顯，表明decorin對關(guān)節(jié)滑膜B型細胞增殖抑制作用主要是使細胞停滯在靜止期，減少合成期和分裂期細胞的數(shù)量，而且這種作用有劑量效應，隨著decorin濃度增大，抑制作用越明顯，但具體能發(fā)揮最好抑制作用的最佳濃度有待深入研究。

如果使創(chuàng)傷愈合纖維瘢痕形成過程中I型膠原纖維合成的絕對量減少，即可有效抑制增生性瘢痕形成［8］，而decorin可與多種膠原分子(主要是I、Ⅱ、Ⅲ型)結(jié)合，阻止膠原分子在局部聚集［9］。其中decorin與I型膠原關(guān)系最為密切，而且decorin至少具有2個I型膠原結(jié)合的位點，Rajiv等［10］研究表明decorin可有效地下調(diào)I、Ⅲ型前膠原的mRNA的表達。本研究通過RT-PCR法檢測I型前膠原蛋白( PcI) mRNA的表達，結(jié)果顯示高濃度( 5 mg/L和10 mg/L)的decorin能明顯抑制關(guān)節(jié)滑膜B型細胞中Pc I mRNA的表達。通過Western blot法檢測I型膠原蛋白的表達，結(jié)果顯示每個時點隨著decorin濃度增高，關(guān)節(jié)滑膜B型細胞合成I型膠原蛋白的量減少，而且高濃度的decorin抑制作用更明顯。由此可見，decorin抑制僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞Ⅰ型膠原蛋白的合成主要是通過下調(diào)Pc I mRNA的表達，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成，抑制膝關(guān)節(jié)滑膜囊纖維瘢痕的形成。

綜上所述，本實驗提示了應用decorin能夠抑制人僵直膝關(guān)節(jié)滑膜B型細胞的活力，同時下調(diào)Ⅰ型前膠原mRNA的表達，減少Ⅰ型膠原蛋白的合成，為防治創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)愈合過程中膝關(guān)節(jié)囊纖維瘢痕的形成，以及創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)僵直的臨床治療提供了一個新的思路。

［參考文獻］

［1］Halper J.Proteoglycans and diseases of soft tissues［J］.Adv Exp Med Biol，2014，802: 49-58.

［2］朱鋒，李紅，吳芳，等.Decorin基因轉(zhuǎn)染抑制高糖培養(yǎng)的大鼠系膜細胞細胞外基質(zhì)mRNA表達［J］.中國病理生理雜志，2007，23( 9) : 1791-1795.

［3］梁遠，王靜成，顏連啟.膝關(guān)節(jié)纖維化治療的研究進展［J］.中國矯形外科雜志，2013，21( 13) : 1313-1316.

［4］Penn JW，Grobbelaar AO，Rolfe KJ，et al.The role of the TGF-β family in wound healing，burns and scarring: a review［J］.Int J Burns Trauma，2012，2( 1) : 18-28.

［5］周清，郭嫻吟，楊筱曦，等.核心蛋白聚糖對翼狀胬肉成纖維細胞增殖的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28( 5) : 919-923.

［6］Reese SP，Underwood CJ，Weiss JA.Effects of decorin proteoglycan on fibrillogenesis，ultrastructure，and mechanics of type I collagen gels［J］.Matrix Biol，2013，32 ( 7-8) : 414-423.

［7］Abdel MP，Morrey ME，Barlow JD，et al.Intra-articular decorin influences the fibrosis genetic expression profile in a rabbit model of joint contracture［J］.Bone Joint Res，2014，3( 3) : 82-88.

［8］邢幫榮，利天增，謝舉臨，等.α1(Ⅰ)型前膠原基因反義寡聚脫氧核苷酸對人增生性瘢痕成纖維細胞生物學特性的影響［J］.中國美容整形外科雜志，2013，24 ( 3) : 152-156

［9］楊國嶸，朱任之，何曉霞，等.膠原沉積抑制因子在大腸桿菌DH5α中的表達特性［J］.中國病理生理雜志，2007，23( 6) : 1219-1222.

［10］Rajiv RM，Rangan G，Maneesh KM，et al.Decorin transfection suppresses profibrogenic genes and myofibroblast formation in human corneal fibroblasts［J］.Exp Eye Res，2010，91( 2) : 238-245.

Effect of decorin on proliferation and collagen type I synthesis of stiff knee joint synovial type B cells

XING Bang-rong1，CHEN Yu-xian2，ZENG Hua1，YANG Xiao-yan1，LIANG Cai-qian1，ZHOU Wei-xiong1，KONG Qing-lei1，HAN Jian-hua1，ZHANG Yong-biao1
(1Department of Emergency，2Department of Orthopaedics，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China.E-mail: zhangyongbiaoo@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of decorin on procollagen type I ( PcI)，mRNA expression，collagen type I synthesis and proliferation of synovial type B cells of stiff knee joint synovial membrane.METHODS: Type B cells of synovial membrane were isolated from the stiff knee joint synovial membrane and cultured in vitro.The cells were treated with decorin at concentrations of 0.1 mg/L，5 mg/L and 10 mg/L.After cultured for 24 h，48 h and 72 h，the cell proliferation rates were measured by MTT colorimetric determination.Cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry.The mRNA level of Pc I was detected by RT-PCR，while collagen type I was measured by Western blot.RESULTS: The proliferation of synovial type B cells was significantly inhibited，the percentage of synovial type B cells at G1phase was significantly increased by 5 mg/L and 10 mg/L decorin ( P＜0.05)，and PcⅠmRNA expression and collagen type I synthesis were significantly decreased.The cells with late apoptosis were not found in control group and experimental groups.CONCLUSION: Recombinant human decorin inhibits synovial type B cell proliferation and decreases PcⅠmRNA expression and collagen type I synthesis in synovial type B cells of stiff knee joint synovial membrane in vitro，suggesting that decorin potentially contributes to the therapy of human knee stiffness.

［KEY WORDS］Knee stiffness; synovial type B cells; Decorin; Collagen typeⅠ

通訊作者△Tel: 020-85252018; E-mail: zhangyongbiaoo@163.com

*［基金項目］廣東省自然科學基金資助項目( No.S2013010015461)

［收稿日期］2015-04-16［修回日期］2015-05-27

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1277-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.022